의 컴퓨터 추적하여있는 분석 후각 행동<em> 초파리</em> 네 사분면의 후각에
Summary
We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
Abstract
신경 생물학의 핵심 과제는 인해 복잡한 행동, 강력한 유전자 기술, 컴팩트 신경계에 적절한 동물의 행동을 안내합니다. 초파리 melanogaster의이 같은 조사를위한 훌륭한 모델 시스템 작동 방법 신경 회로 이해하는 것입니다. 실험실 행동 분석은 장기 (예 : phototaxis, 화성, 감각 학습과 기억) 1-3 대응 행동의 기초가되는 신경 메커니즘을 자연 환경의 특성을 시뮬레이션하고 연구하는 초파리와 함께 사용되어왔다. 특정 신경 하위 집합 레이블을 형질 전환 초파리 라인의 큰 컬렉션의 최근 가용성, 행동 분석은 행동 4-11과 뉴런을 연결하는 중요한 역할을 수행하고있다. 함께 데이터 분석을위한 기본 계산 루틴 다양하고 재현성 패러다임은 다양한 genotyp와 후보 플라이 라인의 빠른 테스트를 위해 필수적이다에스. 특히 유용한 실험 동물, 실험 기간 및 제출 자극의 자연의 수가 유연한 설정입니다. 선택의 분석은 수집 및 분석이 용이 재현 데이터를 생성한다. 여기서는 초파리의 행동 반응을 분석하기위한 시스템 및 프로토콜의 상세한 설명은 많은 네 상 경기장에 날아간 제시한다. 설정은 하나의 후각 자극에 파리의 응답을 분석하기 위해 여기에 사용된다 그러나, 동일한 설치 여러 후각, 시각적 또는 optogenetic 자극, 또는 이들의 조합을 테스트하기 위해 변형 될 수있다. 후각 설정은 냄새에 반응 플라이 집단의 활동을 기록하고 전산 분석 방법은 비행 행동을 정량화 적용됩니다. 수집 된 데이터는 효율적인 데이터 수집 및 실험 조건의 최적화에 필수적인 실험 실행의 빠른 판독을 얻기 위해 분석된다.
Introduction
외부 환경에 적응하고 반응하는 능력은 모든 동물의 생존에 중요하다. 동물은 위험을 피하기 음식을 찾아 내고 동료를 찾고, 이전의 경험에서 배울 필요가있다. 감각 기관은 시각, 화학적 자극 mechanosensory 같은 다양한 수신 및 해석되고 디코딩 될 중추 신경계에이 신호를 전송하는 기능. 뇌는 그러한 음식을 구하고 또는 육식 동물에서 탈출로 인식 환경에 따라 적절한 모터 행동을 지시한다. 감각 기관이 외부 세계를 감지하고 뇌가 디코딩하고 의사 결정을 지시하는 방법, 신경 생물학의 주요 과제는 얼마나 이해.
초파리 melanogaster의 방법 신경 회로 가이드 행동을 조사하기위한 강력한 모델 시스템입니다. 유지 보수가 간단하고 저렴한되고 게다가, 초파리는 많은 다양하고 복잡한 틀에 박힌 행동을 전시, 아직 COMPAC으로 이렇게약 10 만 뉴런의 신경 시스템에서 t. 강력한 유전 기술은 초파리 게놈을 조작하기위한 존재하고, 유전자 변형 라인의 수천 선택적으로 재현 뉴런 10-13의 동일한 하위 집합을 라벨 것을 생성되었습니다. 이러한 형질 전환 라인들은 선택적으로 표지 된 뉴런 (활성화 또는 억제)의 활성을 조작 할 수 있으며, 이러한 조작 방식은 신경 기능 설명서 거동을 조사하기 위해 사용될 수있다.
여러 행동 분석은 다양한 초파리의 행동을 연구하기 위해 개발되었다. 초파리, 많은 동물처럼, 같은 음식을 찾는 동료를 발견하고, 위험을 피할 수 많은 행동 선택을 안내하는 냄새의 감각을 사용합니다. 후각 따라서 외부 자극을 감지하고 적절한 선택을 안내하는 동물의 신경계에 의해 해석하는 방법을 조사에 대한 좋은 감각 시스템입니다. 이와 같이, 세이의 숫자 investiga 개발되어왔다팅의 애벌레와 성인 후각 행동. 전통적으로, 초파리의 후각 행동은 타고난 시금에 사용 후각 행동 3을 배울 수있는 두 개의 선택 T-미로 패러다임에 의해 분석 하였다. 이 분석에서, 약 50 개의 파리 튜브 사이에서 선택을 주어진 하나 관 해당 냄새를 포함하고 다른 하나는 제어 취제 (일반적으로 악취 용매)를 포함한다. 초파리는 선택을 위해 설정된 시간 기간을 부여하고 다른 방에있는 파리의 수를 카운트한다. T 개의 미로는 많은 실험에 대한 간단한 분석이지만, 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 후각 행동은 하나의 시점에서 측정되고,이 시점 전에 만들어진 다른 선택은 폐기된다. 마찬가지로, 인구 내에서 파리의 개별 행동은 무시된다. 또한, T-미로는 에러를 도입 할 수 파리 수동 계산을 필요로한다. 마지막으로, 두 측정 선택이 존재하기 때문에, 본종종 미묘한 행동 변화를 감지하는 데 필요한 통계 전력을 줄일 수 있습니다. 두 선택 T 미로의 대안은 4 분면 (네 필드) 후각 14-18이다. 이 분석에서, 동물은 경기장의 네 모서리의 각이 odorized 공기의 잠재적 인 소스로 가득되는 경기장을 탐구한다. 경기장은 네 실험적으로 정의 냄새 사분면의 형성을 극대화 할 수있는 들이랑 키스를 한거 별 모양이 있습니다. 냄새가 그 코너 중 하나에 공급 된 경우에만 해당 사분면에 포함된다. 동물의 행동은 세 가지 제어 사분면에서 자신의 행동에 비해 쉽게 입력하고 냄새 사분면을 떠날로 추적 될 수 있습니다. 네 사분면 후각 분석 따라서 레코드 많은 실험 아레나 위에 악취 자극 시공간적 행동 반응.
네 개의 사분면 후각이 먼저 Pettersson이 등. (15)와 수의사 등에 의해 개발되었다. (17)을 올 조사개별 기생 벌목의 공장 행동 반응. FAUCHER 등. 18 Semmelhack과 왕 (16)는 개별 초파리의 후각 반응을 모니터링하기 위해 설치 적응. 네 개의 사분면 후각 테스트 취기 및 조건의 넓은 범위를 허용, 매력과 반발 응답에 동일하게 민감하다. 사용자가 작성한 비행 추적 소프트웨어, 알렉스 Katsov (19)에 의해 개발 된 현재 (재료에 자세히 설명) 줄리안 브라운에 의해 유지는 네 사분면의 후각 14,20-23의 최신 구현에 추가적인 장점을 소개했다. 높은 공간에서 동시에 (100) 파리 (27.5 픽셀 / cm) 등 어떤 시점에서 위치, 속도 및 파리의 가속 등의 다양한 매개 변수를 추출 허용 해상도, 시간 (초당 30 프레임)까지 분석 할 수있게되었습니다. 이 냄새 20 파리 '행동 반응의 역학에 대한 조사를 할 수 있습니다 </s>입니다. 이는 전체 추적 기간 모집단 내의 개별 파리의 동일성이 유지되지 않는다는 점에 유의해야한다. 대신, 각 플라이 트랙은 교차하지 않는 한이 같은 비행 트랙 기록된다. 파리는 분기 이후 어느 시점에서, 새로운 트랙이 할당됩니다. (재료 표 상세한) 다른 비디오 캡처 소프트웨어를 포함함으로써, 동일한 구성은가요 추적 기간을 허용하고 더 낮은 프레임 레이트로 이미지를 고려하여 최대 24 시간 동안 파리를 추적하는데 사용될 수있다. 이 옵션은 파리의 알을 낳는 행동을 연구하고 ovipositional 환경 (14) 자신의 신체 위치를 비교하는 데 사용되었다. 네 개의 필드 후각 또한 복합 응답을 연구하는 (예 후각 시각)의 자극을 사용할 수도 있고, 감각 자극의 프레젠테이션 optogenetic 9 thermogenetic 21 자극을 결합. 또한, 높은 시간 해상도의 궤적의 추출을 허용 FO앙상블 데이터 세트의 R 각각의 비행. 따라서,이 방법은 후각 유도 인구 행동과 개별 사회적 상호 작용에 대한 조사를 할 수 있습니다. 이 분석에 의해 생성 된 데이터는 행동 스크린의 네 개의 필드 후각을 사용할 수있게 견고하고 높은 재현성이다.
우리는 4 사분면의 후각 여기를 설치 어셈블리를 설명합니다. 우리는 더 고농도 에틸 프로 피오 네이트의 질문에 답변 사과 사이다 식초와 반발에 대한 응답으로 후각 매력을 분석에서의 사용을 보여줍니다. 마지막으로 설명하고 기록 플라이 추적 데이터의 분석을위한 예시적인 코드를 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 네 개의 필드 후각은 야생형과 돌연변이 초파리는 파리의 큰 인구의 후각 반응을 연구하기위한 다양한 행동 시스템입니다. 각각의 실험은 (설정, 실험 실행, 청소 포함) ~ 1 시간 소요되며, 4-6 실험은 일상적으로 매일 수행 할 수 있습니다. 5 분 동안 40-50 초파리를 이용한 전형적인 분석은 약 450,000 분석을 위해 데이터 포인트를 추적 생성한다. 설명 된 구성은 또한 분의 일까?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Materials
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
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