Of Bilgisayar İzleme tarafından Analiz Edilmiş Olfaktor Davranışlar<em> Drosophila</em> Dört kadranda olfactometer içinde
Summary
We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
Abstract
Nörobiyoloji önemli bir zorluk nedeniyle karmaşık davranışları, güçlü genetik teknikler ve kompakt sinir sisteminde uygun hayvan davranışları yönlendirecek. Drosophila melanogaster tür soruşturmaların için mükemmel bir model sistem işlev nasıl sinir devreleri anlamaktır. Laboratuvar davranış testleri uzun (örneğin Phototaxis, kemotaksis, duyusal öğrenme ve bellek) 1-3 karşılık gelen davranışları altında yatan nöral mekanizmalar doğal çevrenin özelliklerini taklit ve incelemek için Drosophila ile kullanılmıştır. Belirli sinir alt kümelerini etiket transgenik Drosophila hatları büyük koleksiyonları son durumu ile, davranış testleri davranışları 4-11 ile nöronların bağlamak için önemli bir rol almış. Birlikte veri analizi için altta yatan hesaplama rutinleri ile çok yönlü ve tekrarlanabilir paradigmalar, çeşitli genotyp ile aday sinek hatları hızlı testler için vazgeçilmezdires. Özellikle yararlı test edilen hayvanların, deney süresi ve sunulan uyarıcı niteliği sayısında esnek kurulumları vardır. seçim tahlil de kazanmak ve analiz etmek kolay tekrarlanabilir veri oluşturmak gerekir. Burada, Drosophila davranışsal tepkileri tahlil edilmesi için bir sistem ve bir protokol ayrıntılı bir tarifi büyük dört alan alanda uçan sunulmuştur. Kur, tek bir koku uyarana sinek tepkilerini tahlil için kullanılmaktadır; Bununla birlikte, aynı kurulum çok koku, görsel veya Optogenetic uyaranlara, ya da bunların bir kombinasyonu test etmek için modifiye edilebilir. olfactometer kurulum kokuları yanıt sinek popülasyonlarının faaliyet kayıtları ve hesaplamalı analitik yöntemler sinek davranışlarını ölçmek için uygulanır. Toplanan veriler verimli veri toplama ve deneysel koşullar optimizasyonu için gereklidir deneysel çalışma, hızlı okuma-out almak için analiz edilir.
Introduction
Dış ortama uyum ve cevap verme yeteneği bütün hayvanların hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. Bir hayvan, tehlikeleri önlemek yiyecek ararlar ve arkadaşları bulmak ve önceki deneyimlerinden öğrenmek gerekiyor. Duyu sistemleri, görsel, kimyasal ve mechanosensory olarak uyaranlara, çeşitli almak ve yorumlanır ve çözülecek merkezi sinir sistemine bu sinyalleri göndermek için çalışır. Beyin daha sonra yemek için kazarak ya da yırtıcı kaçan olarak algılanan ortama göre uygun motor davranışları, yönlendirir. duyu sistemleri dış dünyayı algılar ve beyin çözer ve kararları yönlendirir nasıl nörobiyoloji önemli bir sorundur nasıl anlamak.
Drosophila melanogaster nasıl nöral devreleri kılavuz davranışları araştırmak için güçlü bir model sistem. Bakımı basit ve ucuz olmasının yanı sıra, Drosophila çok çeşitli ve karmaşık sisteme ait davranışları gösteren, henüz COMPAC ile bunuyaklaşık 100.000 nöron sinir sistemini t. Güçlü genetik teknikler Drosophila genomu işlenmesi için mevcuttur ve transjenik soylarda binlerce selektif ve tekrarlanabilir nöronların 10-13 aynı alt kümelerini etiket olduğu oluşturulmuştur. Bu transgenik çizgiler, seçici olarak etiketli nöronların (aktive veya inhibe) aktivitesini değiştirmek için kullanılabilir ve bu manipülasyonlar kadar sinir işlevleri kılavuz davranışları araştırmak için kullanılabilir.
Çoklu davranış testleri çeşitli Drosophila davranışlarını incelemek için geliştirilmiştir. Drosophila birçok hayvanlar gibi, böyle, yiyecek bulma arkadaşları bulma ve tehlikelerin önlenmesi gibi birçok davranış seçenek, rehberlik için koku alma duygusu kullanın. Koku alma, bu nedenle dış uyaranlara algılanır ve uygun seçimler rehberlik edecek bir hayvanın sinir sistemi tarafından nasıl yorumlandığı araştırmak için iyi bir duyu sistemidir. Bu nedenle, bir çok deney araştırılmak geliştirilmiştirting larva ve yetişkin koku davranışlar. Geleneksel, Drosophila koku davranışlar doğuştan tahlil için kullanılan ve koku davranışları 3 öğrenilebilir iki seçenek T-labirent paradigması ile analiz edilmiştir. Bu testte, yaklaşık 50 sinek iki boru arasında bir seçenek sunulur: bir boru, söz konusu koku içeren ve bir kontrol Deodorantını (genellikle koku çözücü) içerir. Sinekler bir seçim yapmak için zaman belirli bir süre verilir ve daha sonra farklı odacıklarda olan sineklerin sayısı sayılır. T-labirent sayıda deney için basit bir deney de, bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, koku davranışlar yalnızca bir zaman noktasında ölçülür ve bu zaman noktasında önce yapılan farklı seçenek atılır. Benzer şekilde, nüfus içindeki sinekler bireysel davranışları ihmal edilmiştir. Buna ek olarak, T-labirent hataları tanıtmak olabilir sineklerin manuel sayım gerektirir. Son olarak, sadece iki ölçülen seçenek için, bugenellikle ince davranış değişiklikleri tespit etmek için gerekli istatistiki gücünü azaltır. İki seçenek T-labirent bir alternatif dört kadran (dört alanı) olfactometer 14-18 olduğunu. Bu deneyde, hayvanlara arena dört köşesinin her kokulandınlmış hava potansiyel kaynağı ile dolu olan bir ring araştırmak. arena dört deneysel olarak tanımlanmış koku kadranın oluşumunu maksimize etmek bir puckered yıldız şekli vardır. Koku sonra köşelerinden birinde verilirse yalnızca bu tek kadranda yer alıyor. Hayvanların davranışları üç kontrol kadranlarda davranışları karşılaştırıldığında kolaylıkla girdikleri ve koku kadranı terk izlenir ve edilebilir. Dört bölgeli olfactometer tahlil böylece kayıtları büyük bir deneysel arenada üzerinde koku uyaranlara zamansal ve mekansal davranış tepkisi.
Dört bölgeli olfactometer ilk Pettersson ve ark., 15 ve Vet ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. 17 ol araştırmak içinBireysel parazitik Hymenoptera fabrika davranışsal tepkileri. Faucher ve ark., 18 ve Semmelhack ve Wang 16 bireysel Drosophila koku yanıtları izlemek için kurulum uyarladı. Dört bölgeli olfactometer testi koku ve koşulları geniş bir yelpazede için izin, çekici ve itici tepkiler aynı ölçüde hassastır. Özel olarak yazılmış sinek izleme yazılımı, Alex Katsov 19 tarafından geliştirilen ve şu anda (Malzeme ayrıntılı) Julian Brown tarafından yapılmaktadır, dört bölgeli olfactometer 14,20-23 daha yeni uygulamalarına ek avantajlar getirmiştir. Yüksek mekansal aynı anda 100 sinekler (27.5 piksel / cm) ve herhangi bir zaman noktasında pozisyon, hız ve sinekler ivme gibi çeşitli parametreler, ayıklanması sağlar çözünürlük, zamansal (sn 30 kare) kadar tahlil etmek artık mümkün. Bu kokuları 20 sineklerin davranışsal tepkilerin dinamikleri soruşturma sağlar </s> Yukarı. Tüm izleme süresi boyunca nüfus içindeki tek tek sinekler tipi muhafaza değildir, ancak, dikkat edilmelidir. Bunun yerine, her sinek parça kesmeyen sürece iki olarak sinek parça için kaydedilir. sinekler sapmak sonra hangi noktada, yeni parçalar atanır. (Malzeme Tablo ayrıntılı) diğer video yakalama yazılımı birleşmeyle, aynı yapılandırma esnek izleme sürelerini tanır ve daha düşük bir kare hızında görüntü alarak en fazla 24 saat boyunca sinekler izlemek için kullanılabilir. Bu seçenek, sineklerin yumurtlama davranışları incelemek ve ovipositional tercihleri 14 ile vücut pozisyonlarını karşılaştırmak için kullanıldı. Dört alan olfaktometrenin da çok modlu yanıtları çalışma (örneğin, koku ve görsel) uyaranlara kullanılabilir, ya da duyusal uyaranların sunum Optogenetic 9 veya thermogenetic 21 uyarımı birleştirmek. Ayrıca, yüksek zamansal çözünürlük yörüngeleri çıkarma fo izin verirtopluluk veri kümesinde r her sinek. Bu nedenle, yöntem koku güdümlü nüfus davranışları ve aynı zamanda bireysel sosyal etkileşimler hakkında soruşturma sağlar. Bu testte elde edilen veriler, davranışsal ekranlar için dört alan olfaktometrenin kullanılmasına imkan verir, sağlam ve yüksek oranda tekrarlanabilir.
Biz dört kadran olfactometer için buraya kurulum düzeneğini açıklar. Biz daha çok konsantre etil propiyonat cevaben elma sirkesi ve itme cevaben koku cazibe tahlil kullanımını göstermektedir. Son olarak, biz tarif ve kaydedilen sinek izleme verilerinin analizi için örnek kod sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan dört alan olfactometer yabani tip ve mutant Drosophila uçar büyük popülasyonlarının koku yanıtları incelemek için çok yönlü bir davranış sistemdir. Her deney (kurulum, deneysel çalışır ve temizlik dahil) ~ 1 saat sürer ve 4-6 deneyler rutin olarak her gün yapılabilir. 5 dakika boyunca 40-50 sinekler kullanan tipik bir deney yaklaşık 450.000 analiz için veri noktaları paletli oluşturur. tarif edilen konfigürasyon, min gün arasında değişen bir zaman dönemi boyun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Materials
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
- Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
- Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
- Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580 (2014).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
- Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
- Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
- Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
- Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
- Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
- Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
- Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).
- Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
- Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
- Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
- Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
- Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
- Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
- Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
- Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction – The Flywalk. Sci Rep. 2, 361 (2012).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
- Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).
