のコンピュータ追跡することによってアッセイ嗅覚行動<em>ショウジョウバエ</em> 4象限オルファクトメーターで
Summary
We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
Abstract
神経生物学における重要な課題は、適切な動物の行動を導くためにどのように機能するかを神経回路を理解することです。 キイロショウジョウバエは、その複雑な動作、強力な遺伝学的手法、およびコンパクトな神経系に起因する、このような調査のための優れたモデル系です。研究所行動アッセイは、長い自然環境の特性をシミュレートし、対応する行動（ 例えば走光性、走化性、感覚学習と記憶）1-3の基礎となる神経機構を研究するためにショウジョウバエで使用されています。特定の神経のサブセットを標識するトランスジェニックショウジョウバエ系統の大規模なコレクションの最近の可用性により、行動アッセイは、行動4-11でニューロンをリンクするために顕著な役割を担ってきました。一緒にデータ分析のための基本となる計算ルーチンと汎用性と再現性のパラダイムは、様々なgenotypと候補フライラインの迅速検査のために不可欠ですエス。特に有用な試験した動物、実験の期間および提示刺激の自然数で柔軟性がある設定がされています。選択肢のアッセイはまた、取得し、分析することが容易である再生可能なデータを生成する必要があります。ここでは、 ショウジョウバエが大きい4フィールドアリーナでハエの行動反応をアッセイするためのシステムおよびプロトコルの詳細な説明を提示します。セットアップは、単一の嗅覚刺激に対するハエの応答をアッセイするためにここで使用されます。しかしながら、同じ設定を複数の嗅覚、視覚的または光遺伝学の刺激、またはこれらの組み合わせを試験するために修飾することができます。嗅覚計の設定は匂いに応答するハエ集団の活動を記録し、計算の分析方法は、フライ行動を定量化するために適用されます。収集されたデータは、効率的なデータ収集および実験条件の最適化に不可欠であるの実験の迅速な読み出しを得るために分析されます。
Introduction
外部環境に適応し、対応する能力は、すべての動物の生存のために重要です。動物は、危険を避けるため、食品を模索し、仲間を見つけ、以前の経験から学ぶ必要があります。感覚系では、そのような視覚的、化学的および機械刺激のような刺激の多様を受信し、解釈し、復号することが中枢神経系にこれらの信号を送信するように機能します。脳はそのような食品用の餌や捕食者から逃げるよう認知された環境に基づいて適切なモータ動作を、指示します。外界を検出し、どのように脳がデコードし、意思決定を指示し、神経生物学における大きな課題であるかの感覚系を理解します。
キイロショウジョウバエは、どのように神経回路ガイド行動を調査するための強力なモデル系です。維持が簡単で安価であることに加え、 ショウジョウバエは多くの多様で複雑 なステレオタイプの行動を示す、まだCOMPACでそう約100,000ニューロンの神経系をtは。強力な遺伝学的技術は、 ショウジョウバエのゲノムを操作するために存在し、トランスジェニック系統の数千人を選択的かつ再現性のニューロン10-13の同じサブセットを標識することが生成されています。これらのトランスジェニック系統を選択的に標識された神経細胞（活性化または阻害する）の活性を操作するために使用することができ、これらの操作は、どのように神経機能ガイド挙動を調査するために使用することができます。
複数の行動アッセイは、様々なショウジョウバエの行動を研究するために開発されてきた。 ショウジョウバエ 、多くの動物のように、このような、食べ物を見つけるの仲間を見つけて、危険を回避するなど、多くの行動の選択肢を、案内する臭いの感覚を使用しています。嗅覚は、したがって、外部刺激が検出され、適切な選択を導くために、動物の神経系によってどのように解釈されるか調査するための良い感覚システムです。このように、多数のアッセイがinvestigaのために開発されていますティンの幼虫と大人の嗅覚行動。伝統的に、 ショウジョウバエの嗅覚行動は、先天性アッセイするために使用され、嗅覚行動3を学習することができる2つの選択肢のT-迷路パラダイムによってアッセイしました。このアッセイでは、約50ハエは、2つの管の間の選択肢を与えている：1のチューブは、問題の臭気が含まれており、他の制御付臭剤（通常、臭気溶剤）が含まれています。ハエは選択をする時間の設定期間を与えられているし、別の部屋にいるハエの数がカウントされます。 T-迷路は、多くの実験のためのシンプルなアッセイであるが、いくつかの制限があります。例えば、嗅覚行動は、ただ1つの時点で測定され、この時点の前に作られた別の選択は破棄されます。同様に、集団内のハエの個々の行動は無視されます。また、T-迷路はエラーをもたらす可能性があるハエの手動カウントを、必要とします。最後に、2つだけの測定の選択肢があるので、この多くの場合、微妙な行動の変化を検出するのに必要な統計的検出力を低下させます。 2択T-迷路の代わりに、4象限（4フィールド）オルファクト14-18です。このアッセイでは、動物はアリーナの四隅が着臭空気の潜在的な供給源が充填された競技場を探ります。アリーナは4実験的に定義された臭気象限の形成を最大化するためにひだ星形状を有しています。臭いがコーナーの1に供給されている場合、それはそれだけで1象限に含まれています。動物の行動は、彼らが入ると臭いの象限を残すとして追跡し、簡単に3つの制御象限におけるそれらの挙動と比較することができます。 4象限嗅覚計アッセイは、このように大規模な実験的な舞台の上に匂い刺激に対する空間的・時間的行動応答を記録します。
4象限嗅覚計は、最初ペターソンら 15及び獣医らによって開発された。17オールを調査します個々の寄生ハチ目の工場行動反応。フォーシェら 18とSemmelhackと王16は、個々のショウジョウバエの嗅覚応答をモニターするためのセットアップを適応しました。 4象限嗅覚計は、試験臭気物質および条件の広い範囲を可能にする、魅力と反発応答にも同様に敏感です。カスタム書かれたフライ追跡ソフトウェア、アレックスKatsov 19によって開発され、現在ジュリアン・ブラウン（材料で詳述）によって維持されるが、4象限嗅覚計14,20-23のより最近の実装に追加の利点を導入しました。高い空間（27.5ピクセル/ cm）で、そのような任意の時点でのハエの位置、速度、加速度などの各種パラメータを抽出できます一時的な（毎秒30フレーム）の解像度、同時に100ハエまでアッセイすることが可能になりました。これは臭い〜20ハエ」行動反応のダイナミクスの調査を可能にします</s>アップ。全体の追跡期間中、集団内の個々のハエの同一性が維持されないことに留意すべきです。その代わりに、各フライトラックが交差しない限り2としてフライトラックのために記録されています。ハエが発散した後、その時点で、新しいトラックが割り当てられています。 （ 材料表に詳述する）は、他のビデオキャプチャソフトウェアを組み込むことにより、同様の構成は、柔軟な追跡期間を可能にし、より低いフレームレートで画像を撮影することによって、最大24時間のハエを追跡するために使用することができます。このオプションは、ハエの産卵行動を研究し、産卵選好14で自分の体の位置を比較しました。 4フィールド嗅覚計はまた、（ 例えば 、嗅覚と視覚）マルチモーダル刺激に対する応答を研究するために使用することができる、または感覚刺激のプレゼンテーションと光遺伝学9または熱発生を起こす21刺激を組み合わせること。さらに、高い時間分解能がfoの軌跡の抽出を可能にしますアンサンブルデータセット内のrの各個別のフライ。したがって、この方法は、嗅覚ガイド下人口の行動や、個々の社会的相互作用の調査を可能にします。このアッセイによって生成されたデータは、行動画面の4フィールド嗅覚計の使用を可能にする、堅牢かつ再現性の高いです。
我々は、4象限嗅覚計のためにここにセットアップアセンブリを説明します。我々はさらに高度に濃縮されたプロピオン酸エチルに応じて、リンゴ酢と反発力に応じて、嗅覚の魅力をアッセイでの使用を実証します。最後に、我々は説明し、記録されたフライ追跡データの分析のためのサンプル・コードを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明した4つのフィールドの嗅覚計は、野生型および変異体ショウジョウバエハエの大集団の嗅覚応答を研究するための汎用性の高い行動システムです。各実験は、（セットアップ、実験ラン、および洗浄を含む）〜1時間かかり、4-6実験は、日常的に毎日行うことができます。 5分間40~50ハエを使用する典型的なアッセイは、約45万を分析のためにデータポイントを追跡生成しま?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Materials
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
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