Comportamientos olfativas ensayó mediante seguimiento informático de<em> Drosophila</em> En un olfatómetro de cuatro cuadrantes
Summary
We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
Abstract
Un desafío clave en la neurobiología es entender cómo los circuitos neuronales funcionan para guiar los comportamientos adecuados con animales. Drosophila melanogaster es un excelente sistema modelo para este tipo de investigaciones, debido a sus comportamientos complejos, técnicas genéticas de gran alcance, y el sistema nervioso compacto. Ensayos de comportamiento de laboratorio han sido utilizados con Drosophila para simular propiedades del entorno natural y estudiar los mecanismos neurales que subyacen a los comportamientos correspondientes (por ejemplo fototaxis, quimiotaxis, el aprendizaje y la memoria sensorial) 1-3. Con la reciente disponibilidad de grandes colecciones de líneas transgénicas de Drosophila que etiquetan subconjuntos neuronales específicas, ensayos de comportamiento han asumido un papel destacado para vincular las neuronas con comportamientos 4-11. paradigmas versátiles y reproducibles, junto con las rutinas computacionales para el análisis de datos subyacentes, son indispensables para pruebas rápidas de líneas de vuelo con varios candidatos GenotypES. Particularmente útiles son las configuraciones que son flexibles en el número de animales sometidos a ensayo, la duración de los experimentos y la naturaleza de los estímulos presentados. El ensayo de elección también debería generar datos reproducible que es fácil de adquirir y analizar. A continuación, presentamos una descripción detallada de un sistema y el protocolo para ensayar las respuestas de comportamiento de moscas Drosophila en un gran estadio de cuatro campos. La configuración se utiliza aquí para probar las respuestas de las moscas a un único estímulo olfativo; sin embargo, la misma configuración puede modificarse para poner a prueba olfativa múltiple, los estímulos visuales o optogenética, o una combinación de estos. La configuración olfatómetro registra la actividad de las poblaciones de moscas que responden a los olores, y se aplican métodos de análisis computacionales para cuantificar los comportamientos de moscas. Los datos recogidos son analizados para obtener una lectura rápida de una prueba experimental, que es esencial para la recopilación de datos eficiente y la optimización de las condiciones experimentales.
Introduction
La capacidad de adaptarse y responder al entorno externo es fundamental para la supervivencia de todos los animales. Un animal necesita para evitar peligros, buscar comida y encontrar compañeros, y aprender de las experiencias anteriores. Los sistemas sensoriales funcionan para recibir una variedad de estímulos, tales como visual, químicas y mecanosensorial, y enviar estas señales al sistema nervioso central debe ser interpretado y decodificada. Entonces, el cerebro dirige conductas motoras apropiadas basadas en la percepción del medio ambiente, tales como la búsqueda de alimentos o escapar de un depredador. La comprensión de cómo los sistemas sensoriales detectan el mundo exterior, y cómo el cerebro decodifica y dirige las decisiones, es un reto importante en la neurobiología.
Drosophila melanogaster es un sistema poderoso modelo para la investigación de cómo los comportamientos de los nervios de guía circuitos. Además de ser sencillo y barato de mantener, Drosophila exhiben muchos de los comportamientos estereotipados diversas y complejas, sin embargo, lo hacen con un compacT del sistema nervioso de los cerca de 100.000 neuronas. Existen poderosas técnicas genéticas para manipular el genoma de Drosophila, y miles de líneas transgénicas que se han generado de forma selectiva y reproducible etiquetar los mismos subconjuntos de neuronas 10-13. Estas líneas transgénicas se pueden utilizar para manipular selectivamente la actividad de las neuronas marcadas (activar o inhibir), y estas manipulaciones se pueden utilizar para investigar cómo neural comportamientos funciones de guía.
Ensayos de comportamiento múltiples se han desarrollado para el estudio de diversos comportamientos de Drosophila. Drosophila, al igual que muchos animales, usan su sentido del olfato para guiar muchas opciones de comportamiento, tales como la búsqueda de alimentos, la búsqueda de compañeros, y evitar peligros. Por lo tanto, el olfato es un buen sistema sensorial para investigar cómo se detectan e interpretados por el sistema nervioso de un animal para guiar las decisiones adecuadas estímulos externos. Como tal, un número de ensayos han sido desarrollados para Investigalarvario Ting y comportamientos olfativas adultos. Tradicionalmente, los comportamientos olfativas en Drosophila se ensayaron mediante un paradigma laberinto en T de dos elección, que se puede utilizar para ensayar innata y los comportamientos aprendidos olfativas 3. En este ensayo, alrededor de 50 moscas se les da a elegir entre dos tubos: uno de los tubos contiene el olor en cuestión y la otra contiene un odorizante de mando (generalmente el disolvente olor). Las moscas se les da un período determinado de tiempo para tomar una decisión, y después se contó el número de moscas que se encuentran en las diferentes cámaras. Aunque el T-laberinto es un ensayo simple para muchos experimentos, hay varias limitaciones. Por ejemplo, los comportamientos olfativas se miden en un solo punto del tiempo, y diferentes elecciones realizadas antes de este punto de tiempo se descartan. Del mismo modo, los comportamientos individuales de las moscas dentro de la población se descuidan. Además, el laberinto en T requiere conteo manual de las moscas, que puede introducir errores. Finalmente, puesto que sólo hay dos opciones de medición, estereduce la potencia estadística a menudo requerido para detectar sutiles cambios de comportamiento. Una alternativa a una elección de dos T-laberinto es un olfatómetro de cuatro cuadrantes (de cuatro campos) 14-18. En este ensayo, los animales exploran un escenario en el que cada una de las cuatro esquinas de la arena se llena con una posible fuente de aire olorizado. La arena tiene una forma de estrella fruncido para maximizar la formación de cuatro cuadrantes de olor definidos experimentalmente. Si el olor se suministra en una de las esquinas entonces se incluirá solamente en que un cuadrante. Los comportamientos de los animales pueden ser rastreados a medida que entran y salen del cuadrante olor, y fácilmente en comparación con su comportamiento en los tres cuadrantes de control. Así, el ensayo olfatómetro de cuatro cuadrantes registros de respuesta de comportamiento espacial y temporal de los estímulos de olor más de un gran estadio experimental.
El olfatómetro de cuatro cuadrantes fue desarrollado por primera vez por Pettersson et al. 15 y Vet et al. 17 para investigar el ollas respuestas de comportamiento de fábrica de los himenópteros parásitos individual. Faucher et al. 18 y 16 Semmelhack y Wang adaptaron la configuración para supervisar las respuestas olfativas de Drosophila individuo. El olfatómetro de cuatro cuadrantes es igualmente sensible a las respuestas de atracción y repulsión, lo que permite una amplia gama de odorantes y condiciones de ensayo. Software de seguimiento de mosca por encargo por escrito, desarrollado por Alex Katsov 19 y actualmente mantenido por Julian Brown (se detalla en Materiales), presentó ventajas adicionales para las implementaciones más recientes del olfatómetro de cuatro cuadrantes 14,20-23. Ahora es posible ensayar hasta 100 moscas simultáneamente en alta resolución espacial (27,5 píxeles / cm) y temporales (30 cuadros por segundo) de resolución, que permite extraer varios parámetros, tales como posición, velocidad y aceleración de las moscas en cualquier punto de tiempo. Esto permite que las investigaciones sobre la dinámica de las respuestas de comportamiento de las moscas a los olores 20 </sarriba>. Cabe señalar, sin embargo, que la identidad de moscas individuales dentro de la población durante todo el período de seguimiento no se mantiene. En su lugar, cada pista mosca se registra durante el tiempo de dos pistas de la mosca no se cruzan. Momento en el cual, las nuevas pistas se les asignan después de las moscas divergen. Mediante la incorporación de otro software de captura de vídeo (que se detallan en la Tabla Materiales), la misma configuración permite que los períodos de seguimiento flexible y se podría utilizar para realizar un seguimiento de las moscas para un máximo de 24 h por la toma de imágenes a una velocidad inferior. Esta opción se utiliza para estudiar los comportamientos que ponen huevos de moscas y comparar sus posiciones corporales con las preferencias de oviposición 14. El olfatómetro de cuatro campos también se puede utilizar para estudiar las respuestas a multimodal (por ejemplo, olfativos y visuales) estímulos, o para combinar optogenético 9 o 21 thermogenetic estimulación con presentaciones de estímulos sensoriales. Además, la alta resolución temporal permite la extracción de trayectorias for cada una mosca individual en el conjunto de datos de conjunto. Por lo tanto, el método permite la investigación en comportamientos de la población-olfativas guiadas y las interacciones sociales individuales. Los datos generados por este ensayo son robustos y altamente reproducible, lo que permite el uso del olfatómetro de cuatro campos para pantallas de comportamiento.
Se describe aquí el conjunto de configuración para un olfatómetro de cuatro cuadrantes. Además, demuestran su uso en el ensayo de atracción olfativa en respuesta a vinagre de manzana y repulsión en respuesta a propionato de etilo altamente concentrado. Finalmente, describimos y proporcionamos código de ejemplo para el análisis de los datos de seguimiento mosca grabados.
Protocol
Representative Results
Discussion
El olfatómetro de cuatro campos se describe aquí es un sistema de comportamiento versátil para el estudio de las respuestas olfativas de grandes poblaciones de tipo salvaje y mutante moscas Drosophila. Cada experimento tiene ~ 1 hr (incluida la instalación, corridas experimentales, y limpieza), y 4-6 experimentos se puede realizar de forma rutinaria cada día. Un ensayo típico usando 40-50 moscas durante 5 minutos genera aproximadamente 450.000 puntos de datos rastreados para su análisis. La configuració…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Materials
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
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