Comportements olfactifs dosées par Tracking Computer Of<em> Drosophila</em> Dans un Olfactométre quatre quadrants
Summary
We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
Abstract
Un défi majeur en neurobiologie est de comprendre comment les circuits neuronaux fonctionner pour guider les comportements des animaux appropriés. Drosophila melanogaster est un excellent modèle pour de telles enquêtes en raison de ses comportements complexes, techniques génétiques puissants, et le système nerveux compact. Laboratoire des essais de comportement ont longtemps été utilisés avec la drosophile pour simuler les propriétés de l'environnement naturel et d' étudier les mécanismes neuronaux sous – jacents aux comportements correspondants (par exemple phototaxie, chimiotactisme, apprentissage sensoriel et de la mémoire) 1-3. Avec la récente disponibilité de grandes collections de lignées transgéniques Drosophila qui étiquettent des sous – ensembles de neurones spécifiques, tests comportementaux ont pris un rôle de premier plan pour relier les neurones avec des comportements 4-11. paradigmes polyvalents et reproductibles, ainsi que les routines de calcul sous-jacentes à l'analyse des données, sont indispensables pour des tests rapides de lignes de mouches des candidats avec divers genotypes. Sont particulièrement utiles les configurations qui sont flexibles dans le nombre d'animaux testés, la durée des essais et la nature des stimuli présentés. Le dosage de choix devrait également générer des données reproductibles qui sont faciles à acquérir et à analyser. Ici, nous présentons une description détaillée d'un système et d'un protocole pour tester les réponses comportementales de Drosophila vole dans une grande arène de quatre champs. La configuration est utilisée ici pour évaluer la réponse de mouches à un seul stimulus olfactif; cependant, la même configuration peut être modifiée pour tester olfactives multiples, des stimuli visuels ou optogénétiques, ou une combinaison de ceux-ci. La configuration de l'olfactomètre enregistre l'activité des populations de mouches répondant aux odeurs, et les méthodes analytiques de calcul sont appliquées pour quantifier les comportements de mouche. Les données recueillies sont analysées pour obtenir une lecture rapide d'un essai expérimental, ce qui est essentiel pour la collecte de données efficace et l'optimisation des conditions expérimentales.
Introduction
La capacité d'adaptation et de répondre à l'environnement extérieur est essentiel pour la survie de tous les animaux. Un animal a besoin pour éviter les dangers, chercher la nourriture et trouver des partenaires, et d'apprendre des expériences précédentes. Les systèmes sensoriels fonctionnent pour recevoir une variété de stimuli, tels que visuelle, chimique et mécanosensorielle, et envoie ces signaux au système nerveux central doit être interprété et décodé. Le cerveau dirige ensuite les comportements moteurs appropriés en fonction de l'environnement perçu, comme la recherche de nourriture ou échapper à un prédateur. Comprendre comment les systèmes sensoriels détectent le monde extérieur, et comment le cerveau décode et dirige les décisions, est un défi majeur en neurobiologie.
Drosophila melanogaster est un système de modèle puissant pour étudier comment neuronal comportements de guidage des circuits. En plus d' être simple et peu coûteux à entretenir, la drosophile présentent de nombreux comportements divers et complexes stéréotypés, mais le faire avec un compact système nerveux d'environ 100.000 neurones. Techniques génétiques puissants existent pour manipuler le génome de la Drosophile, et des milliers de lignées transgéniques ont été générées que sélectivement et de façon reproductible étiqueter les mêmes sous – ensembles de neurones 10-13. Ces lignées transgéniques peuvent être utilisées pour manipuler sélectivement l'activité des neurones marqués (activer ou inhiber), et ces manipulations peuvent être utilisées pour étudier comment neuronal comportements de guidage des fonctions.
Plusieurs tests comportementaux ont été développés pour étudier divers comportements drosophile. Drosophila, comme beaucoup d' animaux, utilisent leur sens de l' odorat pour guider de nombreux choix de comportement, tels que trouver de la nourriture, trouver copains, et en évitant les dangers. L'olfaction est donc un bon système sensoriel pour étudier comment les stimuli externes sont détectés et interprétés par le système nerveux d'un animal pour guider les choix appropriés. A ce titre, un certain nombre d'essais ont été développés pour Investigating larvaire et les comportements olfactifs adultes. Traditionnellement, les comportements olfactifs chez la drosophile ont été analysés par un paradigme labyrinthe en T à deux choix, qui peut être utilisé pour doser innée et les comportements appris olfactifs 3. Dans cet essai, environ 50 mouches ont le choix entre deux tubes: un tube contenant l'odeur en question et l'autre contient un odorant de commande (généralement le solvant d'odeur). Les mouches sont donnés une période de temps définie pour faire un choix, puis le nombre de mouches qui sont dans les différentes chambres sont comptées. Bien que le labyrinthe en T est un simple test pour de nombreuses expériences, il existe plusieurs limites. Par exemple, les comportements olfactifs sont évalués à un seul point de temps, et les différents choix effectués avant ce point de temps sont rejetées. De même, les comportements individuels des mouches dans la population sont négligées. En outre, le labyrinthe en T nécessite un comptage manuel des mouches, ce qui pourrait introduire des erreurs. Enfin, comme il n'y a que deux choix mesurés, ceréduit la puissance statistique souvent nécessaire pour détecter les changements de comportement subtils. Une alternative à un labyrinthe en T à deux choix est un à quatre quadrants (quatre champs) olfactomètre 14-18. Dans cet essai, les animaux explorent une arène dans laquelle chacun des quatre coins de l'arène est remplie d'une source potentielle d'air odorisé. L'arène a une forme d'étoile froncé pour maximiser la formation de quatre quadrants d'odeurs expérimentalement définis. Si l'odeur est fourni dans l'un des coins, puis il est contenu seulement en ce qu 'un quadrant. Les comportements des animaux peuvent être suivis comme ils entrent et sortent le quadrant des odeurs, et facilement par rapport à leur comportement dans les trois quadrants de contrôle. Le dosage de olfactomètre à quatre quadrants ainsi les dossiers de réponse comportementale spatiale et temporelle des stimuli d'odeurs sur une grande arène expérimentale.
Le olfactomètre à quatre quadrants a d' abord été développé par Pettersson et al. 15 et Vet et al. 17 pour étudier l'olusine réponses comportementales des hyménoptères parasites individuels. Faucher et al 18. Et Semmelhack et Wang 16 adapté le programme d' installation pour surveiller les réponses olfactives de Drosophila individuelle. Le olfactomètre à quatre quadrants est également sensible aux réponses attractives et répulsives, permettant une large gamme de produits odorants et conditions d'essai. Logiciel de suivi de la mouche Custom-écrit, développé par Alex Katsov 19 et actuellement maintenu par Julian Brown (détaillées dans les matériaux), a présenté des avantages supplémentaires aux implémentations plus récentes de l'olfactomètre à quatre quadrants 14,20-23. Il est maintenant possible de tester jusqu'à 100 mouches simultanément à haute spatiale (27,5 pixels / cm) et temporels (30 images par seconde) de résolution, qui permet d'extraire différents paramètres, tels que la position, la vitesse et l'accélération des mouches à tout point de temps. Cela permet à des enquêtes sur la dynamique des réactions comportementales des mouches à odeurs 20 </sup>. Il convient de noter toutefois que l'identité des mouches individuelles au sein de la population au cours de la période de suivi de piste entière n'a pas été maintenue. Au lieu de cela, chaque piste de mouche est enregistré pour aussi longtemps que deux pistes de mouche ne se croisent pas. À ce moment-là, de nouvelles pistes sont attribuées après vol divergent. En intégrant d' autres logiciels de vidéo-capture (détaillées dans le tableau Matériaux), la même configuration permet des périodes de suivi flexibles et pourrait être utilisé pour suivre les mouches jusqu'à 24 heures en prenant des images à une vitesse inférieure. Cette option a été utilisée pour étudier les comportements de ponte de mouches et de comparer leurs positions du corps avec les préférences de ponte 14. Le olfactomètre quatre champ peut également être utilisé pour étudier les réponses à multimodal (par exemple , olfactives et visuelles) stimuli, ou de combiner optogenetic 9 ou thermogénique 21 stimulation avec des présentations de stimuli sensoriels. En outre, la haute résolution temporelle permet l'extraction de trajectoires for chaque mouche individuelle dans l'ensemble de données ensemble. Par conséquent, la méthode permet enquête sur les comportements de la population olfactifs guidée et aussi les interactions sociales individuelles. Les données générées par cet essai sont robustes et très reproductible, ce qui permet l'utilisation de l'olfactomètre quatre trames pour les écrans de comportement.
Nous décrivons ici l'ensemble de configuration pour un olfactomètre à quatre quadrants. Nous démontrons en outre son utilisation dans le dosage de l'attraction olfactive en réponse à vinaigre de cidre et de répulsion en réponse au propionate d'éthyle très concentré. Enfin, nous décrivons et fournissons un exemple de code pour l'analyse des données de suivi de vol enregistrées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le olfactomètre quatre champ décrit ici est un système polyvalent de comportement pour étudier les réponses olfactives des grandes populations de type sauvage et mutant drosophile mouches. Chaque expérience prend ~ 1 h (y compris l'installation, essais expérimentaux, et le nettoyage), et 4-6 expériences peut être effectuée régulièrement chaque jour. Un essai typique utilisant 40-50 mouches pendant 5 minutes génère environ 450.000 suivis de points de données pour l'analyse. La configuratio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Materials
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
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