Olfaktorischen Behaviors Assayed von Computer-Tracking<em> Drosophila</em> In einem Vier-Quadranten-Olfaktometer
Summary
We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
Abstract
Eine zentrale Herausforderung in der Neurobiologie ist zu verstehen , wie neuronale Schaltkreise funktionieren Verhaltensweisen geeignetes Tier zu führen. Drosophila melanogaster ein ausgezeichnetes Modellsystem für solche Untersuchungen aufgrund seiner komplexen Verhaltensweisen, leistungsstarke genetische Techniken ist, und kompakt Nervensystem. Verhaltenstests Laboratory haben lange mit Drosophila verwendet Eigenschaften der natürlichen Umgebung zu simulieren und untersuchen die neuronalen Mechanismen , die entsprechenden Verhaltensweisen zugrunde liegen (zB Phototaxis, Chemotaxis, sensorische Lernen und Gedächtnis) 1-3. Mit der jüngsten Verfügbarkeit von großen Sammlungen von transgenen Drosophila Linien , die spezifische neuronale Untergruppen bezeichnen, haben Verhaltenstests auf eine herausragende Rolle genommen Neuronen mit Verhaltensweisen zu verknüpfen 11.04. Vielseitig und reproduzierbare Paradigmen zusammen mit den zugrunde liegenden Berechnungsroutinen für die Datenanalyse, sind unverzichtbar für schnelle Tests von Kandidaten Fliegenlinien mit verschiedenen genotypes. Besonders nützlich sind Konfigurationen, die getestet in der Anzahl der Tiere, flexibel sind, die Dauer der Experimente und der Art der dargebotenen Stimuli. Der Test der Wahl sollte auch reproduzierbare Daten generieren, die leicht zu erwerben und zu analysieren ist. Hier stellen wir eine detaillierte Beschreibung eines Systems und eines Protokolls zur Bestimmung von Verhaltensreaktionen von Drosophila – Fliegen in einem großen Vierfeld – Arena. Das Setup wird hier Antworten von Fliegen auf einen einzelnen Geruchsreizes zu untersuchen; jedoch kann die gleiche Einstellung mehrerer olfaktorischen, optischen oder optogenetische Stimuli oder eine Kombination von diesen zu testen, modifiziert werden. Die Olfaktometer Einrichtung zeichnet die Aktivität von Fliegenpopulationen auf Gerüche reagieren, und Rechen analytischen Methoden werden angewendet, um Fliegenverhalten zu quantifizieren. Die gesammelten Daten werden analysiert, um ein schnelles Auslesen eines experimentellen Lauf zu erhalten, die für eine effiziente Datenerfassung und die Optimierung der experimentellen Bedingungen wesentlich ist.
Introduction
Die Fähigkeit zur äußeren Umgebung anzupassen und zu reagieren, ist von entscheidender Bedeutung für das Überleben aller Tiere. Ein Tier braucht, Gefahren zu vermeiden, Nahrung suchen und finden mates, und aus früheren Erfahrungen zu lernen. Sensorische Systeme funktionieren eine Vielzahl von Reizen, wie visuelle, chemische und mechanosensorischen, und senden diese Signale an das zentrale Nervensystem zu empfangen, zu interpretieren und decodiert. Das Gehirn leitet dann entsprechende motorische Verhaltensweisen auf der Grundlage der wahrgenommenen Umgebung, wie zum Beispiel Futter für Lebensmittel oder von einem Raubtier zu entkommen. Zu verstehen, wie sensorische Systeme, die die Außenwelt erkennen, und wie das Gehirn und Entscheidungen lenkt decodiert, ist eine große Herausforderung in der Neurobiologie.
Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiges Modellsystem für die, wie neuronale Schaltkreise Führungsverhalten zu untersuchen. Neben halten einfach und kostengünstig ist, zeigen Drosophila viele verschiedene und komplexe Verhaltensweisen schablonenhaft , und doch tun dies mit einem compact Nervensystem von etwa 100.000 Neuronen. Powerful genetische Techniken existieren , um die Drosophila – Genoms für die Manipulation und Tausende von transgenen Linien erzeugt wurden , die selektiv und reproduzierbar die gleichen Untergruppen von Neuronen 10-13 kennzeichnen. Diese transgenen Linien kann verwendet werden, um selektiv die Aktivität der markierten Neuronen manipulieren (aktivieren oder inhibieren), und diese Manipulationen können eingesetzt werden, wie neuronale Funktionen Führungsverhalten zu untersuchen.
Mehrere Verhaltenstests wurden Verhaltensweisen für die Untersuchung verschiedener Drosophila entwickelt. Drosophila, wie viele Tiere, nutzen ihren Geruchssinn für viele Verhaltens Entscheidungen zu führen, wie Nahrung zu finden, finden Kollegen und Gefahren zu vermeiden. Der Geruchssinn ist daher eine gute sensorische System für die Untersuchung, wie äußere Reize werden erkannt und interpretiert von einem Tier das Nervensystem zu entsprechenden Entscheidungen führen. Als solches sind eine Anzahl von Assays für investiga entwickeltting Larven- und Erwachsenen olfaktorische Verhalten. Traditionell wurden durch eine zwei Wahl T-Labyrinth Paradigma getestet, olfaktorische Verhalten in Drosophila, die zur Bestimmung von angeborenen verwendet werden können und gelernt Geruchsverhalten 3. In diesem Test werden etwa 50 Fliegen eine Wahl zwischen zwei Rohren gegeben: ein Rohr enthält den fraglichen Geruch und die andere enthält eine Steuerriechstoff (in der Regel der Geruch Lösungsmittel). Die Fliegen sind eine bestimmte Zeit gegeben, um eine Wahl zu treffen, und dann die Anzahl der Fliegen, die in den verschiedenen Kammern sind gezählt. Obwohl die T-Labyrinth ein einfacher Test für viele Experimente ist, gibt es einige Einschränkungen. Beispielsweise werden olfaktorische Verhalten an nur einem Zeitpunkt gemessen wird, und verschiedene Möglichkeiten vor diesem Zeitpunkt gemacht werden verworfen. In ähnlicher Weise werden die einzelnen Verhalten der Fliegen in der Bevölkerung vernachlässigt. Darüber hinaus erfordert die T-maze manuelles Zählen von Fliegen, die zu Fehlern führen könnte. Schließlich, da es nur zwei gemessenen Auswahl dieserreduziert die statistische Aussagekraft oft zu erkennen subtile Verhaltensänderungen erforderlich. Eine Alternative zu einer Zwei-choice T-Labyrinth ist ein Vier-Quadranten (Vier-Felder) Olfaktometer 14-18. In diesem Test erforschen Tiere eine Arena, in der jeder der vier Ecken der Arena mit einer potentiellen Quelle von odorierten Luft gefüllt ist. Die Arena hat eine gespitzten Sternform, die Bildung von vier experimentell definierten Geruchs Quadranten zu maximieren. Wenn Geruch in einer der Ecken zugeführt wird, dann wird sie enthalten, nur in diesem einen Quadranten. Das Verhalten der Tiere können verfolgt werden, da sie den Geruch Quadranten betreten und verlassen, und leicht im Vergleich zu ihrem Verhalten in den drei Steuer Quadranten. Der Vier-Quadranten-Olfaktometer Assay somit Aufzeichnungen räumliche und zeitliche Verhaltensreaktion auf die Geruchsreize über einen großen experimentellen Arena.
Der Vier-Quadranten – Olfaktometer wurde zuerst von Pettersson et al. 15 und Vet et al. 17 , um die ol zu untersuchenFabrik Verhaltensreaktionen einzelner parasitären Hautflügler. Faucher et al. 18 und Semmelhack und Wang 16 angepasst ist, die Einrichtung , die geruchlichen Reaktionen der einzelnen Drosophila zu überwachen. Der Vier-Quadranten-Olfaktometer ist ebenso empfindlich auf anziehende und abstoßende Reaktionen, so dass für eine breite Palette von Test Geruchs- und Bedingungen. Sonderanfertigungen geschrieben fly – Tracking – Software, entwickelt von Alex Katsov 19 und aktuell gehalten von Julian Brown (detailliert in Materialien), eingeführt zusätzliche Vorteile auf neuere Implementierungen des Vier-Quadranten – Olfaktometer 14,20-23. Es ist nun möglich, 100 fliegt mit hoher räumlicher (27,5 Pixel / cm) und zeitliche (30 Bilder pro Sekunde) Auflösung gleichzeitig zu testen, die unsere verschiedenen Parameter wie Position, Geschwindigkeit und Beschleunigung von Fliegen zu jedem Zeitpunkt erlaubt das Extrahieren. Dies ermöglicht Untersuchungen über die Dynamik der Verhaltensreaktionen auf Gerüche "Fliegen 20 </sup>. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass die Identität der einzelnen Fliegen in der Bevölkerung während der gesamten Verfolgungsperiode nicht aufrecht erhalten wird. Stattdessen wird jeder Flugbahn so lange wie zwei fly Spuren aufgezeichnet nicht schneiden. An welchem Punkt werden neue Spuren zugewiesen, nachdem die Fliegen auseinander. Durch die Integration von anderen Video-Capturing – Software ( die in Werkstoff – Tabelle), kann die gleiche Konfiguration flexible Tracking – Perioden und könnte verwendet werden , Fliegen für bis zu 24 Stunden zu verfolgen , indem Sie Bilder mit einer niedrigeren Bildrate nehmen. Diese Option wurde verwendet , um Eiablageverhalten von Fliegen und vergleichen ihre Körperpositionen mit Eiablage Präferenzen 14 studieren. Das Vier-Feld Olfaktometer kann auch Antworten verwendet werden , um zu studieren , um zu multimodal (zB olfaktorischen und visuellen) Stimuli oder optogenetische 9 oder thermogene 21 Stimulation mit Präsentationen von Sinnesreizen zu kombinieren. Darüber hinaus ermöglicht die hohe zeitliche Auflösung der Extraktion von Trajektorien for jedes einzelne Haar in der Ensemble-Datensatz. Daher ermöglicht das Verfahren Untersuchung in olfaktorischen geführte Bevölkerung Verhaltensweisen und auch individuelle soziale Interaktionen. Die Daten, die durch diesen Test erzeugt sind robust und hoch reproduzierbar, was die Verwendung des Vierfeld-Olfaktometer für Verhaltens Bildschirmen.
Wir beschreiben hier die Setup-Baugruppe für ein Vier-Quadranten-Olfaktometer. Wir zeigen weiterhin, seine Verwendung bei der Untersuchung von olfaktorischen Reiz in Reaktion auf Apfelessig und Abstoßung in Reaktion auf hochkonzentrierte Ethylpropionat. Schließlich beschreiben wir und Beispielcode für die Analyse der aufgezeichneten Flugverfolgungsdaten bereitzustellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Vier-Feld Olfaktometer beschrieben hier ist ein vielseitiges Verhaltenssystem zur Untersuchung der olfaktorischen Reaktionen von großen Populationen von Wildtyp und Mutante Drosophila – Fliegen. Jeder Versuch dauert ca. 1 Stunde (einschließlich Setup, Versuchsdurchläufe und Reinigung), und 4-6 Experimente können routinemäßig jeden Tag durchgeführt werden. Ein typischer Test 40-50 Fliegen für 5 Minuten unter Verwendung erzeugt etwa 450.000 Datenpunkte für die Analyse verfolgt. Die beschriebene Anord…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Materials
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
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