Обонятельные Поведения, испытываемых Computer Отслеживание<em> Drosophila</em> В четырехквадрантном одориметра
Summary
We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
Abstract
Основной проблемой в нейробиологии, чтобы понять , как нейронные цепи функционируют , чтобы направлять соответствующее поведение животных. Дрозофилы является отличной моделью системы для таких исследований из – за его сложного поведения, мощных генетических методов и компактной нервной системы. Лабораторные анализы поведения уже давно используются с дрозофилы для моделирования свойств природной среды и изучение нейронных механизмов , лежащих в основе соответствующих навыков поведения (например , фототаксис, хемотаксис, сенсорное обучение и память) 1-3. С недавнего наличия больших коллекций трансгенных линий дрозофилы , которые маркируют специфические нейронные подмножества, поведенческие тесты взяли на себя заметную роль связать нейроны с поведением 4-11. Универсальность и воспроизводимые парадигм, вместе с основной вычислительной процедуры для анализа данных, необходимы для быстрых испытаний кандидатов летать линий с различными genotypэс. Особенно полезными являются расстановок, которые являются гибкими в количестве подопытных животных, продолжительность эксперимента и природы, представленных раздражителей. Анализ выбора также должен генерировать воспроизводимые данные, которые легко приобрести и анализировать. Здесь мы представляем подробное описание системы и протокола для опробования поведенческие реакции дрозофилы в большом четыре поля арене. Установка используется здесь для анализа ответов мух одного обонятельного стимула; Тем не менее, та же установка может быть изменен, чтобы проверить несколько обонятельные, зрительные или оптогенетика стимулы, или их комбинацию. Установка Ольфактометр регистрирует активность популяций мух реагирующих на запахи, и вычислительные методы анализа применяются для количественной оценки поведения мух. Собранные данные анализируются, чтобы получить быстрый считывание экспериментального пробега, что имеет важное значение для эффективного сбора данных и оптимизации условий эксперимента.
Introduction
Способность адаптироваться и реагировать на них внешней среды имеет решающее значение для выживания всех животных. Животное нуждается, чтобы избежать опасностей, искать еду и найти товарищей, и извлечь уроки из предыдущего опыта. Сенсорные системы функционируют, чтобы получить множество стимулов, таких, как визуальный, химической и механосенсорных, и передать эти сигналы в центральную нервную систему, чтобы быть истолковано и декодируется. Мозг затем направляет соответствующее поведение двигателя на основе воспринимаемой среды, такие как поисках пищи или спасаясь от хищника. Понимание того, как сенсорные системы обнаружения внешний мир, и как мозг декодирует и направляет решения, является одной из основных задач в нейробиологии.
Дрозофилы это мощная системная модель для исследования поведения нейронных хау схемы направляющих. Помимо того , простой и недорогой в обслуживании, Drosophila демонстрируют много разнообразных и сложных стереотипное поведение, но сделать это с COMPACт нервной системы приблизительно 100000 нейронов. Существуют мощные генетические методы для манипулирования геном дрозофилы, и тысячи трансгенных линий были сформированы , которые селективно и воспроизводимо маркировать те же подмножества нейронов 10-13. Эти трансгенные линии могут быть использованы для селективного манипулирования активность меченых нейронов (активировать или ингибировать), и эти манипуляции могут быть использованы, чтобы исследовать, как нейронные поведение функции направляющих.
Многократные поведенческие тесты были разработаны для изучения различных поведения дрозофилы. Drosophila, как и многие животные, используют свое обоняние для направления много поведенческих вариантов, таких как поиск пищи, находить товарищей, и избежать опасности. Поэтому Обоняние является хорошим сенсорная система для исследования, как внешние стимулы обнаруживаются и интерпретируются нервной системы животного, чтобы вести правильный выбор. Таким образом, целый ряд анализов, которые были разработаны для Investigaтин личинками и взрослых обонятельные поведения. Традиционно, обонятельные поведения у дрозофилы анализировали с помощью двух выбора парадигмы Т-лабиринтом, который может быть использован для опробования врожденный и узнал обонятельные поведения 3. В этом анализе, около 50 мух дают выбор между двумя трубками: одна трубка содержит запах о котором идет речь, а другой содержит контрольный одоранта (обычно запах растворителя). Мухи дают определенный период времени, чтобы сделать выбор, а затем количество мух, которые находятся в разных камерах подсчитываются. Хотя Т-лабиринте это простой тест для многих экспериментов, существует несколько ограничений. Например, обонятельные поведения измеряются только в одной временной точке, а также различные выборы, сделанные до этого момента времени отбрасываются. Аналогичным образом, отдельные модели поведения мух в популяции пренебрегают. Кроме того, Т-лабиринтом требует ручного подсчета мух, которые могут привести к ошибкам. Наконец, так как есть только два варианта измеренных, этоснижает статистическую мощность часто требуется, чтобы обнаружить тонкие изменения в поведении. Альтернатива два выбора T-лабиринт является четырехквадрантная (четыре поля) Ольфактометр 14-18. В этом анализе животных исследовать арену, в которой каждый из четырех углов арены наполнен потенциальным источником одоризованный воздуха. Арена имеет сморщенный форму звезды, чтобы максимизировать образование четырех экспериментально определенных квадранта запаха. Если запах подается в одном из углов то она содержится только в этом одном квадранте. Поведение животных можно отследить, как они входят и выходят из запах квадрант, и легко по сравнению с их поведением в трех квадрантах управления. Таким образом Ольфактометр анализа четырехквадрантная записи пространственной и временной поведенческой реакции на раздражители запах над большой экспериментальной арене.
Четырехквадрантная Ольфактометр была впервые разработана Петерсон и др. 15 и Vet и др. 17 , чтобы исследовать олаЗаводские поведенческие реакции индивидуального паразитических перепончатокрылых. Faucher и др. 18 и Semmelhack и Ван 16 приспособлены установки для контроля обонятельные реакции индивидуального дрозофилы. Четырехквадрантная Ольфактометр одинаково чувствителен к притяжения и отталкивания ответов, что позволяет в широком диапазоне испытаний отдушек и условий. Специально написанная программа отслеживания муха, разработанная Alex Кацов 19 и в настоящее время поддерживается Джулиан Браун (подробно в разделе Материалы), были введены дополнительные преимущества для более поздних реализаций четырехквадрантном ольфактометр 14,20-23. Теперь стало возможным для анализа до 100 мух одновременно с высоким пространственным (27.5 пикселей / см) и по времени (30 кадров в секунду) разрешение, которое позволяет извлекать различные параметры, такие как положение, скорость и ускорение мух в любой момент времени. Это дает возможность исследования в динамике поведенческих реакций мух "запахов 20 </sвверх>. Следует отметить, однако, что идентичность отдельных мух в популяции в течение всего периода наблюдения не поддерживается. Вместо этого, каждая муха дорожка записывается так долго, как две мухи треки не пересекаются. В этот момент, новые треки назначены после того, как мухи расходятся. Объединив другие видео-захвата программное обеспечение (подробно в таблице материалов), такая же конфигурация позволяет гибкие периоды отслеживания и может быть использована для отслеживания мух до 24 часов, принимая изображения при более низкой частоте кадров. Этот вариант был использован для изучения яйцекладка поведения мух и сравнить их положение тела с ovipositional предпочтений 14. Четыре поля Ольфактометр также могут быть использованы для изучения реакции на мультимодальные (например , обонятельные и зрительные) раздражители, или сочетать оптогенетика 9 или thermogenetic 21 стимуляцию с презентациями сенсорных стимулов. Кроме того, высокое временное разрешение позволяет извлечение траекторий Foг каждая отдельная муха в ансамбле набора данных. Таким образом, метод позволяет исследовать в обонятельных наведением поведения населения, а также отдельных социальных взаимодействий. Данные, полученные с помощью данного анализа являются надежными и высокой воспроизводимостью, что обеспечивает использование четырех полевых ольфактометр поведенческих экранов.
Мы опишем здесь сборку установки для четырехквадрантном ольфактометр а. Мы также продемонстрировать его использование в опробование обонятельный привлекательность в ответ на яблочный уксус и отталкивание в ответ на высококонцентрированного этилового эфира пропионата. Наконец, мы опишем и предоставить пример кода для анализа записанных данных отслеживания муха.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ольфактометр четыре поля , описываемого здесь является универсальным поведенческая система для изучения обонятельные реакции крупных популяций дикого типа и мутанта дрозофилы. Каждый эксперимент занимает ~ 1 час (в том числе установки, опытов и очистки), и 4-6 экспериментов можно р?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Materials
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
- Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
- Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
- Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580 (2014).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
- Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
- Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
- Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
- Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
- Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
- Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
- Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).
- Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
- Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
- Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
- Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
- Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
- Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
- Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
- Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction – The Flywalk. Sci Rep. 2, 361 (2012).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
- Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).
