Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de<em> Drosophila</em> Em um olfatômetro de quatro quadrantes
Summary
We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
Abstract
Um dos principais desafios em neurobiologia é entender como os circuitos neurais funcionam para orientar comportamentos adequados com animais. Drosophila melanogaster é um excelente sistema modelo para tais investigações devido aos seus comportamentos complexos, técnicas genéticas poderosas e sistema nervoso compacto. Ensaios comportamentais laboratoriais têm sido muito utilizados com Drosophila para simular propriedades do ambiente natural e estudar os mecanismos neurais subjacentes aos comportamentos correspondentes (por exemplo fototaxia, quimiotaxia, a aprendizagem sensorial e memória) 1-3. Com a recente disponibilidade de grandes coleções de linhas de Drosophila transgênicas que rotulam subconjuntos neurais específicos, ensaios comportamentais têm assumido um papel de destaque para conectar neurônios com comportamentos 4-11. paradigmas versáteis e reprodutíveis, em conjunto com as rotinas computacionais subjacentes para análise de dados, são indispensáveis para testes rápidos de linhas de voar candidatos com vários genotypes. Particularmente úteis são as configurações que são flexíveis no número de animais testados, a duração das experiências e a natureza dos estímulos apresentados. O ensaio de escolha também deve gerar dados reprodutível, que é fácil de obter e analisar. Aqui, apresentamos uma descrição detalhada de um sistema e protocolo para ensaiar respostas comportamentais de Drosophila voa em uma grande arena de quatro campos. A configuração é usado aqui para ensaiar respostas de moscas para um único estímulo olfativo; No entanto, o mesmo arranjo pode ser modificado para testar múltiplos olfactivo, estímulos visuais ou optogenetic, ou uma combinação destes. A configuração olfatômetro registra a atividade de populações de moscas que respondem aos odores e métodos analíticos computacionais são aplicadas para quantificar os comportamentos da mosca. Os dados coletados são analisados para obter uma rápida leitura fora de uma corrida experimental, que é essencial para a coleta de dados eficiente e a otimização das condições experimentais.
Introduction
A capacidade de adaptação e respondem ao ambiente externo é crítica para a sobrevivência de todos os animais. Um animal precisa para evitar perigos, procurar comida e encontrar companheiros, e aprender com experiências anteriores. sistemas sensoriais funcionar para receber uma variedade de estímulos visuais, tais como, química e mecanosensorial, e envia esses sinais para o sistema nervoso central a ser interpretada e descodificado. O cérebro, em seguida, direciona comportamentos motores apropriadas com base no ambiente percebido, como a busca de alimento ou escapar de um predador. Entender como sistemas sensoriais detectar o mundo externo, e como o cérebro decodifica e dirige decisões, é um grande desafio em neurobiologia.
Drosophila melanogaster é um sistema poderoso modelo para investigar como neural comportamentos circuitos de guia. Além de ser simples e barata de manter, Drosophila apresentam muitos comportamentos diversos e complexos estereotipada, mas fazê-lo com uma compact sistema nervoso de cerca de 100.000 neurônios. Existem técnicas genéticas poderosas para manipular o genoma de Drosophila, e milhares de linhas transgénicas foram geradas que seletivamente e reprodutível rotular os mesmos subconjuntos de neurônios 10-13. Estas linhas transgénicas podem ser usadas para manipular selectivamente a actividade dos neurónios marcados (activar ou inibir), e estas manipulações podem ser utilizados para investigar como neural comportamentos funções de guia.
Vários ensaios comportamentais têm sido desenvolvidos para estudar vários comportamentos de Drosophila. Drosophila, como muitos animais, use seu sentido de cheiro para guiar muitas escolhas comportamentais, tais como encontrar comida, encontrar companheiros e evitar perigos. Olfato é, portanto, um bom sistema sensorial para investigar como os estímulos externos são detectados e interpretados pelo sistema nervoso de um animal para orientar as escolhas apropriadas. Como tal, uma série de ensaios foram desenvolvidos para Investigating larval e comportamentos olfativos adultos. Tradicionalmente, os comportamentos olfactivos em Drosophila foram ensaiadas por um paradigma de labirinto em T de dois escolha, que pode ser utilizado para ensaiar inata e comportamentos aprendidos olfactivos 3. Neste ensaio, cerca de 50 moscas são dado uma escolha entre dois tubos: um tubo contém o odor em questão e o outro contém um odorante de controlo (normalmente o solvente odor). As moscas são dadas um determinado período de tempo para fazer uma escolha, e, em seguida, o número de moscas que estão nas diferentes câmaras são contados. Embora o labirinto em T é um ensaio simples para muitas experiências, há várias limitações. Por exemplo, comportamentos olfativos são medidos em apenas um ponto no tempo, e diferentes escolhas feitas antes deste ponto de tempo são descartados. Da mesma forma, os comportamentos individuais das moscas dentro da população são negligenciadas. Além disso, o labirinto em T requer a contagem manual das moscas, que pode introduzir erros. Finalmente, uma vez que existem apenas duas opções de medição, estereduz o poder estatístico muitas vezes necessária para detectar mudanças comportamentais sutis. Uma alternativa para um dois-escolha T-maze é um de quatro quadrantes (quatro campos) olfatômetro 14-18. Neste ensaio, os animais explorar uma arena em que cada um dos quatro cantos da arena é preenchido com uma fonte potencial de ar odorizado. A arena tem uma forma de estrela enrugada para maximizar a formação de quatro quadrantes de odor experimentalmente definidos. Se o odor é fornecido em um dos cantos em seguida, é contida apenas em que um quadrante. Os comportamentos dos animais pode ser rastreado como eles entram e saem do quadrante odor, e facilmente em comparação com o seu comportamento nos três quadrantes de controle. Assim, o ensaio olfatômetro de quatro quadrantes registros de resposta comportamental espacial e temporal aos estímulos odor mais de uma grande arena experimental.
O olfatômetro de quatro quadrantes foi desenvolvido pela primeira vez por Pettersson et al. 15 e Vet et al. 17 para investigar o olrespostas comportamentais fábrica de Hymenoptera parasítica indivíduo. Faucher et al. 18 e Semmelhack e Wang 16 adaptada a configuração para monitorar as respostas olfativas de Drosophila individual. O olfactómetro de quatro quadrantes é igualmente sensível às respostas atractivas e repulsivas, permitindo uma vasta gama de condições de ensaio e odorantes. Software de rastreamento fly escrita por encomenda, desenvolvido por Alex Katsov 19 e atualmente mantido por Julian Brown (detalhado em Materiais), apresentou vantagens adicionais para implementações mais recentes do olfatômetro de quatro quadrantes 14,20-23. É agora possível testar até 100 moscas simultaneamente em alta resolução espacial (27,5 pixels / cm) e temporais (30 quadros por segundo) de resolução, que permite extrair vários parâmetros, tais como posição, velocidade e aceleração de moscas em qualquer ponto do tempo. Isso permite que as investigações sobre a dinâmica das respostas comportamentais das moscas aos odores 20 </s-se>. Deve notar-se, no entanto, que a identidade de moscas individuais dentro da população durante todo o período de seguimento não é mantido. Em vez disso, cada faixa mosca é registrado por até duas faixas mosca não se cruzam. Em que ponto, novas faixas são atribuídos após as moscas divergem. Ao incorporar outro software de captura de vídeo (detalhado na Tabela de Materiais), a mesma configuração permite períodos de monitoramento flexível e pode ser usado para controlar moscas por até 24 horas, tomando imagens a uma taxa de quadros mais baixa. Esta opção foi utilizada para estudar os comportamentos que põem ovos de moscas e comparar suas posições corporais com as preferências oviposição 14. O olfactómetro de quatro campos podem também ser utilizados para estudar as respostas para multimodal (por exemplo, olfativas e visuais) estímulos, ou para combinar optogenetic 9 ou 21 termogênico estimulação com apresentações de estímulos sensoriais. Além disso, a resolução temporal alta permite que a extracção de trajectórias for cada mosca individual no conjunto de dados ensemble. Portanto, o método permite investigação sobre comportamentos da população olfativos-guiada e também interações sociais individuais. Os dados gerados por este ensaio são robustos e altamente reprodutível, que permite a utilização do olfactómetro de quatro campos para telas comportamentais.
Descrevemos aqui o conjunto de instalação para um olfatômetro de quatro quadrantes. Demonstramos ainda mais a sua utilização no ensaio de atração olfativa em resposta ao vinagre de maçã e repulsão em resposta ao propionato de etilo altamente concentrado. Finalmente, descreve-se e proporcionar o Exemplo de código para a análise dos dados de controlo de mosca gravados.
Protocol
Representative Results
Discussion
O olfactómetro de quatro campos descrito aqui é um sistema comportamental versátil para estudar as respostas olfativas de populações grandes de tipo selvagem e mutante de Drosophila moscas. Cada experiência leva ~ 1 hr (incluindo instalação, ensaios experimentais, e limpeza) e 4-6 experimentos podem ser realizados rotineiramente a cada dia. Um ensaio típico usando 40-50 moscas durante 5 minutos gera aproximadamente 450.000 rastreados pontos de dados para análise. A configuração descrita, também pod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Materials
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
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