Olfactory Behaviors analysert av Computer sporing av<em> Drosophila</em> I en fire-kvadranten olfactometer
Summary
We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
Abstract
En sentral utfordring i nevrobiologi er å forstå hvordan nevrale kretser fungere å veilede aktuelle dyreatferd. Drosophila melanogaster er et utmerket modellsystem for slike undersøkelser på grunn av sin komplekse atferd, kraftige genetiske teknikker og kompakt nervesystemet. Laboratorieatferdsanalyser har lenge vært brukt med Drosophila å simulere egenskapene til det naturlige miljøet og studere nevrale mekanismene bak de tilsvarende atferd (f.eks phototaxis, chemotaxis, sensoriske læring og hukommelse) 1-3. Med den nylige tilgjengelighet av store samlinger av transgene Drosophila linjer som merke spesifikke nevrale undergrupper, har atferdsanalyser tatt på en fremtredende rolle for å knytte nevroner med atferd 4-11. Allsidige og reproduserbare paradigmer, sammen med de underliggende beregnings rutiner for dataanalyse, er uunnværlig for raske tester av kandidat snører med ulike genotypes. Spesielt nyttig er oppsett som er fleksible i det antall dyr som ble testet, varighet av forsøk og arten av presentert stimuli. Analysen av valget bør også generere reproduserbare data som er lett å skaffe og analysere. Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av et system og protokoll for å analysere atferdsmessige reaksjoner av Drosophila fluer i en stor firefeltarena. Oppsettet er brukt her for å analysere svarene av fluer til en enkelt lukte stimulus; imidlertid, kan det samme oppsett bli modifisert for å teste flere olfaktorisk, visuelle eller optogenetic stimuli, eller en kombinasjon av disse. Den olfactometer oppsett registrerer aktiviteten til flue populasjoner reagerer på lukt, og beregnings analytiske metoder brukes for å kvantifisere flue atferd. De innsamlede dataene blir analysert for å få en rask utlesning av en forsøkskjøring, noe som er en forutsetning for effektiv datainnsamling og optimalisering av eksperimentelle betingelser.
Introduction
Evnen til å tilpasse seg og svare på det ytre miljø er avgjørende for overlevelsen av alle dyr. Et dyr må unngå farer, oppsøke mat og finne kamerater, og lære av tidligere erfaringer. Sensoriske systemer fungere for å motta en rekke stimuli, slik som visuell, kjemisk og mechanosensory, og sender disse signalene til sentralnervesystemet til å bli tolket og dekodet. Hjernen styrer deretter passende motor atferd basert på det som oppfattes som miljø, for eksempel i henhold til mat eller rømmer fra et rovdyr. Forstå hvordan sensoriske systemene oppdager den ytre verden, og hvordan hjernen dekoder og dirigerer beslutninger, er en stor utfordring i nevrobiologi.
Drosophila melanogaster er et kraftig modellsystem for å undersøke hvordan nevrale kretser guide atferd. Foruten å være enkel og billig å vedlikeholde, Drosophila oppviser mange varierte og komplekse stereotyp oppførsel, men likevel gjør det med et kompakt nervesystemet på om lag 100.000 neuroner. Kraftige genetiske teknikker finnes for å manipulere Drosophila genomet, og tusenvis av transgene linjer har blitt generert som selektivt og reproduserbart merke de samme undergrupper av nerveceller 10-13. Disse transgene linjer kan benyttes for selektivt å manipulere aktiviteten til de merkede nevroner (aktivere eller inhibere), og disse manipulasjoner kan bli brukt til å undersøke hvordan neurale funksjoner førings atferd.
Flere atferdsanalyser har blitt utviklet for å studere ulike Drosophila atferd. Drosophila, i likhet med mange dyr, bruke luktesansen for å styre mange atferdsmessige valg, for eksempel å finne mat, finne kamerater, og unngå farer. Luktesans er derfor en god sensorisk system for å undersøke hvordan ytre stimuli blir oppdaget og tolket av et dyrs nervesystemet til å veilede riktige valg. Som sådan, har en rekke analyser er utviklet for undersokelserting larve og voksen olfactory atferd. Tradisjonelt ble olfactory atferd hos Drosophila analysert ved en to-valg T-labyrint paradigme, som kan brukes for analyse av medfødt og lært olfactory atferd 3. I denne analysen er omtrent 50 fluer gitt et valg mellom to rør: en tube inneholder lukt aktuelle og den andre inneholder en styre odorant (vanligvis den luktende løsningsmiddel). Fluene er gitt en viss periode av tid til å gjøre et valg, og deretter antall fluer som er i de forskjellige kamrene telles. Selv om T-labyrint er en enkel analyse for mange forsøk, er det flere begrensninger. For eksempel er olfactory oppførsel måles ved bare ett tidspunkt, og forskjellige valg som er gjort før dette tidspunkt blir forkastet. Tilsvarende er de individuelle atferd av fluene i befolkningen neglisjert. I tillegg krever den T-labyrint manuell telling av fluer, som kan introdusere feil. Til slutt, siden det er bare to målte valg, dennereduserer den statistiske kraften ofte nødvendig for å oppdage subtile atferdsendringer. Et alternativ til et to-valg T-labyrint er en fire-kvadrant (fire-felt) olfactometer 14-18. I denne analysen, dyr utforske en arena hvor hver av de fire hjørnene av arenaen er fylt med en potensiell kilde til tilsatt luft. Arenaen har en rynket stjerneform for å maksimere dannelsen av fire eksperimentelt definerte lukt kvadranter. Hvis lukt tilføres i ett av hjørnene, så den inneholdt bare i at en kvadrant. Atferd av dyrene kan spores som de kommer inn og la lukt kvadranten, og lett i forhold til deres oppførsel i de tre kontroll kvadranter. De fire-kvadranten olfactometer analyse dermed poster romlig og tidsmessig atferds reaksjon på lukt stimuli enn en stor eksperimentell arena.
De fire-kvadranten olfactometer ble først utviklet av Pettersson et al. 15 og Vet et al. 17 for å undersøke olfabrikkatferdsmessige reaksjoner av enkelte parasittiske Hymenoptera. Faucher et al. 18 og Semmelhack og Wang 16 tilpasset oppsett for å overvåke olfactory svarene av individuell Drosophila. De fire-kvadrant olfactometer er like følsom for attraktive og frastøtende responser, noe som åpner for et bredt utvalg av test odoranter og tilstander. Skredder skrevet fly sporing programvare, utviklet av Alex Katsov 19 og for tiden vedlikeholdt av Julian Brown (beskrevet i Materials), innført ytterligere fordeler til nyere implementeringer av de fire-kvadranten olfactometer 14,20-23. Det er nå mulig å analysere opp til 100 fluer samtidig ved høy romlig (27,5 piksler / cm) og temporale (30 rammer per sekund) oppløsning, noe som gjør det mulig å ekstrahere ulike parametre, slik som posisjon, hastighet og akselerasjon av fluer som helst punkt. Dette gjør undersøkelser i dynamikken i de flyr "atferdsmessige reaksjoner på lukt 20 </sopp>. Det bør imidlertid bemerkes at identiteten til individuelle fluer innenfor populasjonen i løpet av hele sporingstiden ikke er opprettholdt. I stedet er hver flue spor registreres for så lenge som to flue sporene ikke krysser hverandre. På hvilket tidspunkt, blir nye spor tildelt etter fluene divergere. Ved å innlemme andre video-fange programvare (beskrevet i Materialer tabell), gjør det samme konfigurasjon fleksible sporing perioder, og kan brukes til å spore fluer i opptil 24 timer ved å ta bilder med en lavere bildefrekvens. Dette alternativet ble brukt til å studere egg-legging atferd av fluer og sammenligne sine kroppsstillinger med ovipositional preferanser 14. De fire felt olfactometer kan også brukes til å studere reaksjoner på multimodal (f.eks olfactory og visuelle) stimuli, eller å kombinere optogenetic 9 eller thermogenetic 21 stimulering med presentasjoner av sensoriske stimuli. Videre gir den høye tidsoppløsningen til utvinning av baner for hver enkelt flue i ensemblet datasettet. Derfor kan metoden etterforskningen luktstyrt befolknings atferd og også individuelle sosiale interaksjoner. De data som genereres av denne analysen er robust og svært reproduserbar, slik at for bruk av fire felt olfactometer for atferdsSkjermer.
Vi beskriver her oppsettet forsamlingen for en fire-kvadranten olfactometer. Vi viser videre bruk i analyse av lukte tiltrekning som svar på eple cider eddik og frastøtning som svar på svært konsentrert etylpropionat. Til slutt beskriver vi og gi eksempel kode for analyse av de registrerte flue sporingsdata.
Protocol
Representative Results
Discussion
De fire-feltet olfactometer beskrevet her er et allsidig atferdssystem for å studere olfactory svarene av store bestander av villtype og mutant Drosophila fluer. Hvert eksperiment tar ~ 1 time (inkludert oppsett, eksperimentelle går, og rengjøring), og 4-6 eksperimenter kan rutinemessig utført hver dag. En typisk analyse ved bruk av 40-50 fluer i 5 minutter genererer tilnærmet 450000 sporet datapunkter for analyse. Den beskrevne konfigurasjon, kan også anvendes, med mindre modifikasjoner, for å overvåke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Materials
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
- Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
- Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
- Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580 (2014).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
- Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
- Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
- Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
- Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
- Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
- Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
- Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).
- Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
- Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
- Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
- Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
- Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
- Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
- Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
- Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction – The Flywalk. Sci Rep. 2, 361 (2012).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
- Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).
