Lukt beteenden analyserades med dator Spårning av<em> Drosophila</em> I en fyra-kvadranten olfaktometem
Summary
We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
Abstract
En viktig utmaning i neurobiologi är att förstå hur neurala kretsar fungerar att styra lämpliga djurbeteenden. Drosophila melanogaster är ett utmärkt modellsystem för sådana undersökningar på grund av dess komplexa beteenden, kraftfulla genetiska tekniker och kompakt nervsystemet. Laboratoriebeteendemässiga analyser har länge använts med Drosophila för att simulera egenskaperna hos den naturliga miljön och studera de neurala mekanismerna bakom motsvarande beteenden (t.ex. phototaxis, kemotaxi, sensorisk inlärning och minne) 1-3. Med den senaste tidens tillgång till stora samlingar av transgena Drosophila rader som märka specifika neurala grupper, har beteendemässiga analyser fått en framträdande roll för att länka nervceller med beteenden 4-11. Mångsidig och reproducerbara paradigm, tillsammans med den underliggande beräkningsrutiner för dataanalys, är oumbärliga för snabba tester av kandidat fluglinor med olika genotypes. Särskilt användbara är inställningar som är flexibla i antalet testade djur, längd experiment och natur presenterade stimuli. Analysen av val bör också generera reproducerbara data som är lätt att förvärva och analysera. Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av ett system och protokoll för att analysera beteendemässiga reaktioner av Drosophila flyger i en stor fyra fält arena. Installationen används här för att analysera svaren från flugor till en enda lukt stimulans; emellertid kan samma inställning ändras för att testa flera lukt, visuella eller optogenetic stimuli, eller en kombination av dessa. Den olfaktometem inställning registrerar aktiviteten hos flyga populationer svarar för lukter, och beräknings analysmetoder används för att kvantifiera flyga beteenden. Insamlade data analyseras för att få en snabb avläsning av en experimentell körning, vilket är viktigt för effektiv datainsamling och optimering av experimentella betingelser.
Introduction
Förmågan att anpassa sig och svara på den yttre miljön är avgörande för överlevnaden av alla djur. Ett djur måste undvika faror, söka mat och hitta kompisar, och lära av tidigare erfarenheter. Sensoriska system fungerar för att ta emot en mängd olika stimuli, såsom visuell, kemiska och mechanosensory, och sända dessa signaler till det centrala nervsystemet för att tolkas och avkodas. Hjärnan styr sedan lämpliga motor beteenden baserat på den upplevda miljön, såsom födosök för mat eller fly från ett rovdjur. Att förstå hur sensoriska system upptäcker den yttre världen, och hur hjärnan avkodar och styr beslut, är en stor utmaning i neurobiologi.
Drosophila melanogaster är ett kraftfullt modellsystem för att undersöka hur neurala kretsar styr beteenden. Förutom att vara enkel och billig att underhålla, Drosophila uppvisar många olika och komplexa stereotypa beteenden, men gör det med en compact nervsystemet av cirka 100.000 neuroner. Kraftfulla genetiska tekniker finns för att manipulera Drosophila genomet, och tusentals transgena linjer har genererats som selektivt och reproducerbart märka samma delmängder av nervceller 10-13. Dessa transgena linjer kan användas för att selektivt manipulera aktiviteten hos de märkta neuroner (aktivera eller hämma), och dessa manipulationer kan användas för att undersöka hur neurala funktioner styr beteenden.
Flera beteendemässiga analyser har utvecklats för att studera olika Drosophila beteenden. Drosophila, liksom många djur, använder sitt luktsinne för att styra många beteende val, såsom att hitta mat, att hitta kompisar, och undvika faror. Olfaction är därför en bra sensoriska systemet för att undersöka hur externa stimuli detekteras och tolkas av ett djurs nervsystem för att styra lämpliga val. Som sådan, har ett antal analyser utvecklats för undersökting larv och vuxna lukt beteenden. Traditionellt har lukt beteenden i Drosophila analyseras av ett två-val T-labyrint paradigm, som kan användas för att analysera medfödda och lärde lukt beteenden 3. I denna analys är cirka 50 flugor ges ett val mellan två rör: en tub innehåller doft i fråga och den andra innehåller en styrluktämne (vanligtvis lukten lösningsmedel). Flugorna ges en viss tid att göra ett val, och sedan antalet flugor som finns i de olika kamrarna räknas. Även om T-labyrinten är en enkel analys för många experiment, finns det flera begränsningar. Till exempel är lukt beteenden mäts vid en enda tidpunkt, och olika val som gjorts före denna tidpunkt förkastas. På liknande sätt är de enskilda beteenden av flugorna inom befolkningen försummas. Dessutom kräver T-labyrinten manuell räkning av flugor, som kan införa fel. Slutligen, eftersom det finns endast två uppmätta val, dettaminskar statistisk kraft ofta krävs för att upptäcka subtila beteendeförändringar. Ett alternativ till en två-val T-labyrint är en fyra-kvadranten (fyra fält) olfaktometem 14-18. I denna analys, djur utforska en arena där vart och ett av de fyra hörnen av arenan är fylld med en potentiell källa till luktsatt luft. Arenan har en rynkad stjärnform för att maximera bildandet av fyra experimentellt definierade lukt kvadranter. Om lukten levereras i ett av hörnen så är det endast återfinns i att en kvadrant. De beteenden hos djuren kan spåras när de kommer in och lämnar lukt kvadranten, och enkelt jämfört med deras beteende i de tre kontroll kvadranter. De fyra-kvadranten olfaktometem analys därmed rekord rumsliga och tidsmässiga beteende svar på lukt stimuli över en stor experiment arena.
De fyra-kvadranten olfaktometem utvecklades först av Pettersson et al. 15 och Vet et al. 17 att undersöka olfabriken beteendemässiga reaktioner enskilda parasit Hymenoptera. Faucher et al. 18 och Semmelhack och Wang 16 anpassat setup för att övervaka luktsvar enskilda Drosophila. Den fyra-kvadranten olfaktometer är lika känsliga för attraktiva och repulsiva svar, vilket möjliggör ett brett spektrum av testluktämnen och villkor. Anpassad skrivna fly spårningsprogram, som utvecklats av Alex Katsov 19 och underhålls av Julian Brown (beskrivs i Material), infördes ytterligare fördelar för senare implementeringar av fyra-kvadranten olfaktometem 14,20-23. Det är nu möjligt att analysera upp till 100 flugor samtidigt med hög spatial (27,5 pixlar / cm) och temporala (30 bildrutor per sekund) upplösning, som gör det möjligt att utvinna olika parametrar, såsom position, hastighet och acceleration av flugor vid någon tidpunkt. Detta gör det möjligt för undersökningar av dynamiken i flugor beteende svar på lukt 20 </supp>. Det bör dock noteras, att identiteten hos enskilda flugor i befolkningen under hela uppföljningsperioden inte upprätthålls. Istället är varje flyga spår in så länge som två flyga spår inte korsar varandra. Vid vilken punkt är nya låtar tilldelas efter flugorna isär. Genom att införliva andra video fångande programvara (beskrivs i Material tabell), medger samma konfiguration flexibla spårningsperioder och kan användas för att spåra flugor i upp till 24 timmar genom att ta bilder med en lägre bildhastighet. Detta alternativ användes för att studera äggläggande beteenden hos flugor och jämföra deras kroppspositioner med ovipositional preferenser 14. De fyra fält olfaktometem kan också användas för att studera svar till multimodala (t.ex. lukt och visuella) stimuli, eller att kombinera optogenetic 9 eller thermogenetic 21 stimulering med presentationer av sensoriska stimuli. Vidare medger den höga tidsupplösning utvinning av banor for varje enskild fluga i ensemblen datamängden. Därför tillåter metoden utredning lukt guidad befolknings beteenden och även enskilda sociala interaktioner. De data som genereras av denna analys är robusta och mycket reproducerbar, vilket möjliggör användning av fyra fält olfaktometem för beteende skärmar.
Vi beskriver här inställningsanordning för en fyra-kvadranten olfaktometem. Vi visar ytterligare dess användning vid analys lukt attraktion som svar på äppelcidervinäger och repulsion som svar på starkt koncentrerad etylpropionat. Slutligen, vi beskriva och ge exempel kod för analys av de registrerade flyga spårningsdata.
Protocol
Representative Results
Discussion
De fyra fält olfaktometem beskrivs här är ett mångsidigt beteendesystem för att studera lukt svaren från stora populationer av vild-typ och mutant Drosophila flyger. Varje experiment tar ~ 1 timme (inklusive installation, experimentella körningar, och rengöring), och 4-6 experiment kan rutinmässigt varje dag. En typisk analys med användning av 40-50 flugor i 5 minuter genererar cirka 450.000 banddatapunkter för analys. Den beskrivna konfigurationen kan också användas, med mindre modifieringar, för…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Materials
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
- Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
- Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
- Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580 (2014).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
- Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
- Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
- Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
- Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
- Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
- Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
- Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).
- Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
- Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
- Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
- Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
- Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
- Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
- Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
- Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction – The Flywalk. Sci Rep. 2, 361 (2012).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
- Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).
