体外成像和荧光标记的GnRH类似物的药物靶向性的定量分析
Summary
选择性标记的荧光的GnRH-I，-II和-III衍生物对于跟踪可靠的工具和量化它们的细胞摄取。这个手稿介绍实验来可视化，量化和比较在各种细胞系这些GnRH的缀合物的吸收效率。
Abstract
GnRH类似物是有效的靶向部分和能够提供抗癌剂选择性为恶性肿瘤细胞，其高表达的GnRH受体。然而，GnRH类似物'细胞摄取的定量分析以及基于GnRH的药物递送系统的研究的细胞类型，目前的限制。以前介绍过，选择性荧光标记的GnRH I，-II和-III衍生产品提供了很大的可探测性，和他们有重复性的和健壮的实验合适的化学性质。我们还发现，适当的向上的最新方法与这些标记GnRH类似物能够提供有关基于促性腺激素释放激素的药物递送系统的新信息。该原稿介绍关于[D-赖氨酸6（FITC）]的细胞摄取了一些简单的和快速的实验-促性腺激素释放激素I，D-赖氨酸6（FITC）〕 -的GnRH-II和[赖氨酸8（FITC）〕 -的GnRH -III在EBC-1（肺），在中BxPC-3（胰腺）和底特律-562-（咽）恶性Ťumor细胞。在与这些的GnRH-FITC缀合物平行，促性腺激素释放激素-1受体的细胞表面水平也之前和促性腺激素释放激素治疗通过共聚焦激光扫描显微镜后检查了这些细胞系。的GnRH-FITC缀合物的细胞摄取是通过荧光激活细胞分选进行定量。在这些实验中观察到GnRH类似物和细胞类型之间的主要区别之间的微小差别。其中细胞系的显著差异有其独特的细胞表面的GnRH-I受体水平相关。引入的实验包含实用的方法来可视化，量化和在各种粘附细胞培养以时间和浓度依赖的方式进行比较的GnRH-FITC缀合物的吸收效率。这些结果可以预测在给定的细胞培养物的GnRH偶联物的药物靶向效率，并提供用于在基于促性腺激素释放激素的药物递送系统的检查的进一步实验的良好基础。
Introduction
基于肽靶向给药系统已成为癌症治疗中一个快速显影和希望的领域，在过去几年中1,2。人促性腺激素释放激素受体I型（GnRH的-IR）是主要位于脑垂体，但也存在于其他几个它们负责自我繁殖3的组织。的GnRH-IR也表示在许多癌组织中，相关或无关的生殖系统4,5。促性腺激素释放激素-IR的几种恶性肿瘤细胞高表达与正常组织相比，提供了有针对性的治疗5,6的机会。
许多促性腺激素释放激素（GnRH）类似物已在过去的几十年中，它可以用来作为靶向部分开发F“> 7，8，9，这些肽是能够提供以高选择性抗癌剂为恶性肿瘤细胞，其过量表达的GnRH-IR 6。几种的GnRH偶联的抗肿瘤药物具有更高的选择性和更高的效率比相应的未缀合游离药物已经报道了7，8，9。
有关的GnRH肽及其受体以前的出版物报道，GnRH的红外可以假设具有不同的选择性GnRH类似物10的各种构象。高度可变的GnRH-IR已复杂和各种信号通路被赋予了对他们的自然和人工配体11个不同的活动。这些事实使得基于促性腺激素释放激素系统的调查具有挑战性。另一方面，在 Ÿ具有前途的治疗潜力。用放射性标记的GnRH肽几个实验以前报道12， 第13， 第 14，第 15，但实验，其中使用荧光标记的GnRH类似物仍然有限。而放射性标记具有高灵敏度，荧光标记有几个其他的优点，例如容易处理，并用不同的荧光团给染液的能力。已成功地被用于药物递送三种常见GnRH类似物是[D-赖氨酸6] -GnRH-I，D-赖氨酸6] -GnRH-II和GnRH的-Ⅲ，但这些肽的作为靶向部分的有效性是很少相比16，17。另一方面，在其中不同的癌细胞和GnRH类似物被用于从不同的实验结果是多样的。
ntent“>基于这些考虑，我们集中在肿瘤靶向和药物递送的潜在这些的GnRH肽的，并且由此合成和表征的[D-赖氨酸6（FITC）〕 -的GnRH-I，D-赖氨酸6（FITC ）〕 -的GnRH-II和[赖氨酸8（FITC）〕 -的GnRH-III肽缀合物18这些类似物有选择地与FITC标记上的他们的赖氨酸或D-赖氨酸（肽-FITC比率侧链1:1每个。缀合物），其思想是，选择性荧光标记可以提供有关这些肽新颖的信息，并允许他们的良好的跟踪和可靠的定量。这些结合物具有安全处理和可靠探测，这使得它更容易比较他们的肿瘤靶向效率，并且许多类型的恶性肿瘤细胞的筛选，我们希望达至最新的实验与这些肽偶联物可能有助于新型癌症的靶向发展促性腺激素释放激素药物结合物，并有助于发现新的治疗焦油得到为好。本手稿演示用的GnRH-FITC结合物以及一些重复性好，快速实验。的GnRH-R的细胞表面表达是关于GnRH的摄取决定性条件，因此我们同时研究了所测试的细胞系中的GnRH-1R的细胞表面水平。我们可视通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）GnRH的IR和GnRH的-FITC缀合物和使用荧光激活细胞分选（FACS）定量的GnRH-FITC缀合物的细胞摄取。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文所述实验中使用的选择性标记GnRH类似物进行筛选粘附 细胞培养体外 。共聚焦显微镜和流式细胞仪方法适合于跟踪和量化以时间和浓度依赖的方式，这些的GnRH-FITC缀合物的细胞摄取。这些实验有以下关键步骤：1）保持无菌的，健康的细胞培养物; 2）的GnRH肽必须是高质量的; 3）合理的浓度和孵育时间必须遵循; 4）一种治疗和洗涤步骤; 5）以及调整仪器设置。
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).
Materials
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
- Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11 (2016).
- Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
- Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues. Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).
- Schally, A. V., et al. Hypothalamic hormones and cancer. Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).
- Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
- Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
- Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
- Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
- Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
- Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -. L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
- Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
- Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
- Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
- Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
- Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists – A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
- Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
- Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
- Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).
