체외 이미징 및 형광 표지의 GnRH 유사체의 약물 표적 효율성의 정량에서
Summary
선택적으로 표지 된 형광의 GnRH-I는 -II 및 -III 파생 상품은 안정적인 추적을위한 도구와 자신의 세포 흡수를 정량화 있습니다. 이 원고는 시각화, 정량화 및 다양한 세포주에서 이들의 GnRH 접합체의 흡수 효율을 비교하는 실험을 소개합니다.
Abstract
의 GnRH 유사체 효과적인 표적 부분과 선택적으로 악성 종양 세포에있는 높은 표현의 GnRH 수용체에 항암제를 제공 할 수 있습니다. 그러나의 GnRH 유사체 '세포 흡수의 정량 분석의 GnRH 계 약물 전달 시스템의 연구 세포 종류는 현재 제한된다. 이전에 도입, 선택적으로 표지 된 형광의 GnRH I, -II 및 -III 유도체 좋은 검출 감도를 제공하고, 그들은 재현하고 강력한 실험에 적합한 화학적 특성이 있습니다. 우리는 이러한 라벨의 GnRH 유사체에 해당하는 최신 방법은 GnRH에 기반 약물 전달 시스템에 대한 새로운 정보를 제공 할 수있는 것으로 나타났습니다. 의 GnRH-I, [D-리스 6 (FITC)] – -의 GnRH-II와 [리스 8 (FITC)] – GnRH에이 원고는 [D-리스 6 (FITC)]의 세포 흡수에 관한 몇 가지 간단하고 빠른 실험을 소개합니다 EBC-1 (폐)에 -III의 BxPC-3 (췌장)와 디트로이트-562- (인두)에 악성 tumor 세포. 이들의 GnRH-FITC 접합체와 병렬로는 GnRH-I 수용체의 세포 표면 수준은 이전과 공 초점 레이저 주사 현미경으로 GnRH의 처리 후에 이들 세포주를 조사 하였다. 의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수는 형광 – 활성화 세포 선별에 의해 정량화 하였다. 이러한 실험에서의 GnRH 유사체 및 세포 유형 간의 주요 차이점 중 사소한 차이가 관찰되었다. 세포주 간의 유의 한 차이는 세포 표면의 GnRH-I 수용체의 자신의 고유 한 수준의 상관 관계가있다. 도입 된 실험은 시각화, 정량화 및 각종 접착 세포 배양에 시간과 농도 의존적으로의 GnRH-FITC 접합체의 흡수 효율을 비교하는 실제적인 방법을 포함한다. 이러한 결과는 소정의 세포 배양에서의 GnRH 접합체 약물 타겟팅 효율을 예측하고, GnRH에 기반 약물 전달 시스템의 시험에서 추가 실험을위한 좋은 기초를 제공 할 수있다.
Introduction
펩타이드 계 표적 약물 전달 시스템은 지난 몇 년 동안 1, 2를 통해 암 치료에 빠른 개발 및 유망 영역이되었다. 인간의 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 수용체 타입 I (는 GnRH-IR) 주로 뇌하수체에 위치뿐만 아니라 3자가 재생산을 담당 여러 다른 조직에 존재한다. 의 GnRH-IR은 생식계 -4,5- 관련된 또는 무관 한, 암 조직의 개수로 표현된다. 건강한 조직과 비교하여 여러 가지의 악성 종양 세포의 GnRH-IR의 높은 발현은 표적 치료 (5, 6)에 대한 기회를 제공한다.
많은 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH에) 유사체 잔기를 표적으로 사용할 수 지난 수십 년에 개발되어왔다F "> 7, 8, 9. 이러한 펩티드는 악성 종양 세포에 높은 선택성을 가진 항암제를 제공 할 수있는 위에 표현의 GnRH-IR 6. 대응하는 접합보다 높은 선택성 및 더 나은 효율 몇몇 GnRH의 공액 항암 약물 무료 약물, 9 8 7보고되었다.
의 GnRH 펩타이드 및 그 수용체에 대한 이전 서적은의 GnRH-IR은 GnRH에 10 유사체에 대해 서로 다른 선택이 다양한 입체를 가정 할 수 있다고보고했다. 고도로 변수의 GnRH-IR은 복잡하고 다양한 신호 전달 경로는 자연과 인공 리간드 (11)에 대한 다른 활동이 부여되어있다. 이러한 사실은 GnRH에 기반 시스템의 조사가 도전합니다. 한편, Y는 유망한 치료 가능성을 가지고있다. 방사성 표지의 GnRH 펩티드와 몇 가지 실험을 이전하는 형광 표지의 GnRH 유사체가 사용 된 12, 13, 14, 15,하지만 실험을보고되었다 여전히 제한되어 있습니다. 방사성 표지는 고감도를 제공하는 동안, 형광 표식은 여러 다른 장점, 예를 들면, 취급이 용이하고, 다른 형광체와 Counterstain과 능력을 갖는다. 성공적 약물 전달에 사용 된 일반적인 세의 GnRH 유사체는 -GnRH-I, [D-리스가 6] -GnRH-II와의 GnRH-III 있지만 타겟팅 잔기 이들 펩타이드의 효과 인 [6 D-리스]입니다 거의, 17 (16)을 비교합니다. 한편, 다른 암세포의 GnRH 유사체 사용 된 별도의 실험 결과는 다양하다.
이러한 고려 사항을 바탕으로 ntent는 "> 우리는 이들의 GnRH 펩티드의 대상으로 종양 및 약물 전달의 가능성에 집중하여 합성하고, [D-리스 6 (FITC)] 특징 -의 GnRH-I, [D-리스 6 (FITC를 )] -는 GnRH-II 및 [리스 8 (FITC)] -의 GnRH-III 펩티드 접합체 (18)이 유사 선택적 그들의리스 또는 D-리스 (펩티드 FITC 비 측쇄 1 FITC로 표지되어 각각에서 하나. 접합체). 아이디어는 선택적 형광 표식이 펩티드에 대한 새로운 정보를 제공하고, 그 양호한 추적 및 신뢰성 정량화를 허용 할 수 있다고 하였다. 이들 콘쥬 게이트는 쉽게 그들의 종양 타겟팅 효율을 비교할 수 있도록 안전한 취급 및 신뢰성 검출 능력을 가지며, 악성 종양 세포의 많은 종류의 선별. 우리는 최대 이러한 펩티드 접합체와 날짜 실험의 GnRH – 약물 접합체를 타겟팅하는 신규 한 암의 발전에 기여하고, 새로운 치료 타르를 식별하는 데 도움이 될 수있는 희망뿐만 아니라 가져옵니다.본 원고의 GnRH-FITC 접합체 일부 잘 재현하고 빠른 실험을 보여줍니다. 는 GnRH-R의 세포 표면 발현은 거기서 동시에 시험 세포주에서의 GnRH-IR의 세포 표면 수준을 조사, GnRH에 대한 흡수 한정적 조건이다. 우리는 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)으로의 GnRH-IR과의 GnRH-FITC 접합체를 시각화 한 형광 – 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수를 정량.
Protocol
Representative Results
Discussion
실험은 선별을 위해 선택적으로 부착 표지의 GnRH 유사체를 사용하여 본원에 기재된 시험 관내 세포 배양. 공 초점 현미경과 세포 계측법 방법은 추적에 적합하고, 시간과 농도 의존적으로 이들의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수를 정량화되어 흐른다. 이 실험은 다음과 같은 중요한 단계 : 1) 멸균 건강한 세포 배양 물을 유지하는 단계; 2)의 GnRH 펩타이드는 고품질이어야합니다; 3) 적당한…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).
Materials
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
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