In Vitro Imaging en kwantificering van de Drug Targeting Efficiency van fluorescent gelabelde GnRH analogen

Summary

Selectief gemerkte fluorescerende GnRH-I, -II en -III derivaten betrouwbare middelen voor het opsporen en kwantificeren van de cellulaire opname. Dit manuscript introduceert experimenten te visualiseren, kwantificeren en te vergelijken de opname efficiëntie van deze GnRH conjugaten in diverse cellijnen.

Abstract

GnRH-analogen zijn effectief doelgerichte eenheden en in staat om antikanker middelen te leveren selectief in kwaadaardige tumorcellen die zeer uitdrukkelijke GnRH-receptoren. Echter, de kwantitatieve analyse van cellulaire opname GnRH analogen en de onderzochte celtypen in-GnRH gebaseerde geneesmiddelafgiftesystemen momenteel beperkt. Eerder introduceerde, selectief gelabeld fluorescerende GnRH I, -II en -III derivaten zorgen voor een grote detecteerbaarheid, en ze hebben voldoende chemische eigenschappen voor reproduceerbare en robuuste experimenten. We vonden ook dat de nodige up-to-date methoden met deze gelabeld GnRH-analogen roman informatie over de GnRH-based drug delivery systemen kon bieden. Dit manuscript introduceert een aantal eenvoudige en snelle experimenten met betrekking tot de cellulaire opname van [D-Lys ⁶ (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC)] – GnRH-II en [Lys ⁸ (FITC)] – GnRH -III op de EBC-1 (long), de BxPC-3 (alvleesklier) en de Detroit-562- (farynx) maligne tumor cellen. Parallel aan deze GnRH-FITC-conjugaten werd het celoppervlak niveau van GnRH-I receptoren onderzocht in de volgende cellijnen voor en na de behandeling met GnRH confocale laser scanning microscopie. De cellulaire opname van GnRH-FITC-conjugaten werd gekwantificeerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering. In deze experimenten kleine verschillen tussen GnRH analogen en grote verschillen tussen celtypes waargenomen. De significante verschillen tussen cellijnen worden gecorreleerd met hun verschillende niveau van celoppervlakte GnRH-I receptoren. De geïntroduceerde experimenten bevatten praktische methoden te visualiseren, kwantificeren en vergelijk de opname-efficiëntie van GnRH-FITC-conjugaten in een tijd- en concentratieafhankelijke wijze op verschillende hechtende celculturen. Deze resultaten kunnen de drug targeting efficiëntie van GnRH conjugaten op de gegeven celkweek te voorspellen, en bieden een goede basis voor verdere experimenten in het onderzoek van GnRH-gebaseerde drug delivery systemen.

Introduction

Peptide-gebaseerde gerichte toediening van medicijnen systemen zijn uitgegroeid tot een snelle ontwikkeling en veelbelovend gebied in de behandeling van kanker in de afgelopen jaren ^{1, 2.} Menselijke gonadotropin-releasing hormone receptor type I (GnRH-IR) is voornamelijk in de hypofyse, maar is ook aanwezig in verschillende andere weefsels die verantwoordelijk zijn voor zelfreproductie ³ zijn. GnRH-IR zich ook in een aantal kankerweefsels, al dan niet verbonden met het voortplantingssysteem ^{4, 5.} De hoge expressie van GnRH-IR verschillende kwaadaardige tumorcellen in vergelijking met gezonde weefsels biedt een gelegenheid voor gerichte therapie ^{5, 6.}

Veel gonadotropin-releasing hormone (GnRH) analogen ontwikkeld in de afgelopen decennia, die kunnen worden gebruikt als richtende delenf "> ^{7, 8, 9.} Deze peptiden kunnen antikankermiddelen met hoge selectiviteit geven in kwaadaardige tumorcellen die overexpressie GnRH-IR ^6. Verscheidene GnRH geconjugeerd anti-tumor geneesmiddelen met hogere selectiviteit en hoger rendement dan de corresponderende niet-geconjugeerde vrije geneesmiddel gerapporteerd ^{7, 8, 9.}

Vorige publicaties over GnRH-peptiden en hun receptoren gemeld dat de GnRH-IR verschillende conformaties die verschillende selectiviteit hebben voor GnRH analogen ¹⁰ kan aannemen. De sterk wisselende GnRH-IR is complex en diverse signaalwegen zijn begiftigd met verschillende activiteiten tegen hun natuurlijke en kunstmatige liganden ^11. Deze feiten maken onderzoek naar GnRH-gebaseerde systemen uitdagend. Anderzijds, de y bezitten veelbelovende therapeutisch potentieel. Verschillende experimenten met gelabeld GnRH peptiden werden eerder gemeld ^{12, 13, 14, 15,} maar experimenten waarbij fluorescent gelabelde GnRH analogen werden nog beperkt. Terwijl radioactief merken biedt een hoge gevoeligheid, fluorescente labeling heeft een aantal andere voordelen, zoals de eenvoudige bediening en de mogelijkheid om tegenkleuring met verschillende fluoroforen. Drie gemeenschappelijke GnRH-analogen die met succes zijn gebruikt voor geneesmiddelafgifte zijn [D-Lys ^6] -GnRH-I, [D-Lys ^6] -GnRH-II en GnRH-III, maar de doeltreffendheid van deze peptiden als doelgerichte eenheden is zelden vergeleken ^{16, 17.} Aan de andere kant, resultaten van afzonderlijke experimenten waarin verschillende kankercellen en GnRH analogen werden gebruikt divers.

ntent "> Op basis van deze overwegingen hebben we ons gericht op de tumor targeting en geneesmiddelafgifte potentieel van deze GnRH peptiden en daardoor gesynthetiseerd en gekarakteriseerd het [D-Lys ⁶ (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC )] – GnRH-II en [Lys ⁸ (FITC)] – GnRH-III peptideconjugaten ¹⁸ Deze analogen worden selectief gelabeld met FITC aan de zijketen van hun Lys of D-Lys (peptide-FITC verhouding 1: 1 naar elkaar. conjugaat). het idee was dat de selectieve fluorescentielabelling nieuwe informatie over deze peptiden kunnen bieden, en maakt hun goede tracking en betrouwbare kwantificatie. deze conjugaten veilig hanteren en betrouwbaar detecteerbaarheid, die het gemakkelijker om hun tumor targeting efficiëntie te vergelijken, en de screening van verschillende typen kwaadaardige tumorcellen. We hopen dat up-to-date experimenten met deze peptide-conjugaten kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe kanker gericht GnRH-geneesmiddel conjugaten en helpen nieuwe therapeutische tar identificerenkrijgt ook.

De huidige manuscript toont een aantal goed reproduceerbare en snelle experimenten met GnRH-FITC conjugaten. Het celoppervlak expressie van GnRH-R bepalende voorwaarde van GnRH opname dus we gelijktijdig onderzocht het celoppervlak niveau van GnRH-IR van de geteste cellijnen. We gevisualiseerd de GnRH-IR en GnRH-FITC conjugaten van confocale laser scanning microscopie (CLSM) en gekwantificeerd de cellulaire opname van GnRH-FITC conjugaten middels fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).

Protocol

1. Bereiding van celkweken en reagentia Handhaaf de celkweken de fabrikant aanbevolen medium, aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum en antibiotica (zogenaamde volledig medium). Houd de celcultuur kolf in een bevochtigde, 5% CO2 atmosfeer incubator bij 37 ° C. Volg de proliferatie en samenvloeiing van de cellen door omgekeerde microscoop (met behulp van 10X fase objectieve contrast). Wanneer de cellen voldoende samenvloeiing bereiken, verwijder het medium, en was de cultuur met 2-…

Representative Results

Afbeeldingen verkregen door confocale laser scanning microscopie (CLSM) bieden een spectaculair informatie over de opname van GnRH-FITC conjugaten van de gegeven celkweek in een tijd en concentratie afhankelijke wijze. Parallel aan deze GnRH-FITC conjugaten, de aanwezigheid van de GnRH-IR op het celoppervlak ook controleerbaar door de CLSM experiment. Verder kan door toepassing van een ver-rode kleuring DNA fluorescente probe, is het mogelijk om de kernen van cellen tegenkleuring naast G…

Discussion

Experimenten hierin beschreven gebruiken selectief gelabeld GnRH analogen voor screening hechtende celculturen in vitro. Confocale microscopie en flowcytometrie werkwijzen zijn geschikt voor het volgen en kwantificeren van de cellulaire opname van deze GnRH-FITC-conjugaten in een tijd en concentratie afhankelijke wijze. Deze experimenten hebben de volgende belangrijke stappen: 1) handhaven van een steriele, gezonde celkweek; 2) GnRH-peptiden moet van hoge kwaliteit zijn; 3) redelijke concentraties en…

Materials

EBC-1	JCRB Cell Bank	JCRB0820	Human lung squamous cell carcinoma
BxPC-3	ATCC	CRL-1687	Human pancreatic adenocarcinoma
Detroit-562	ATCC	CCL-138	Human pharyngeal carcinoma
RPMI-1640 Medium with L-glutamine	Lonza	BE12-702F	Culture medium for BxPC-3 cells
Eagle's Minimum Essential Medium	Lonza	BE12-611F	Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells
Fetal Bovine Serum	Euro Clone	ECS0180L	Complements the culture medium
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2012	Complements the culture medium (antibiotics)
Standard Line Cell Culture Flasks	VWR	10062-872	Provide consistent, sterile growth environment for cells
Trypsin-EDTA Mixture	Lonza	BE17-161E	Remove attached cells
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Lonza	BE17-516F	Solvent
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	Solvent
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	Used to counting cells
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I	made by us	–	Purity ≥98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II	made by us	–	Purity ≥98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-III	made by us	–	Purity ≥98% (HPLC)
glass bottom 8-well microscopic slide	Ibidi	80826	Use in CLSM experiment
Corning Costar cell culture plate, 12 well	Sigma-Aldrich	CLS3513-50EA	Use in FACS experiment
Fixing solution (10% neutral buffered formalin)	Bio-Optica	01V60P	Fix adherent cells
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G	Prevent the nonspecific binding of the antibodies
GnRHR Antibody	Proteintech	19950-1-AP	Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors
Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A11035	Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody
Fluorescent probe solution (Draq5)	Thermo Fisher Scientific	62254	Counterstain nuclei
Fluoromount Aqueous Mounting Medium	Sigma-Aldrich	F4680-25ML	Use in CLSM experiment, preserving fluorescence
Inverted microscope	Elektro-Optika Ltd.	Alpha XDS-2T	Check the phenotype and confluency of cell cultures
Inverted confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM-710	Use in CLSM experiment
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur	Use in FACS experiment