In - vitro - Bildgebung und Quantifizierung des Drug Targeting Efficiency von fluoreszierend markierten GnRH - Analoga
Summary
Selektiv markierte fluoreszierende GnRH-I, -II und -III – Derivate sind zuverlässige Werkzeuge für die Verfolgung und ihre zelluläre Aufnahme zu quantifizieren. Diese Handschrift stellt Experimente zu visualisieren, zu quantifizieren und die Aufnahmeeffizienz dieser GnRH-Konjugate in verschiedenen Zelllinien zu vergleichen.
Abstract
GnRH-Analoga sind effektive Targeting-Einheiten und in der Lage Anti-Krebs-Mittel, die hoch express GnRH-Rezeptoren selektiv in malignen Tumorzellen zu liefern. Allerdings sind die quantitative Analyse der GnRH-Analoga "zelluläre Aufnahme und die untersuchten Zelltypen in GnRH-basierten Wirkstoffabgabesysteme derzeit begrenzt. Zuvor eingeführt, selektiv markierte fluoreszierende GnRH-I, -II und -III-Derivate bieten große Nachweisbarkeit, und sie haben geeignete chemische Eigenschaften für reproduzierbare und robuste Experimente. Wir fanden auch, dass die entsprechenden up-to-date Methoden mit dieser markierten GnRH-Analoga neue Informationen über die GnRH-basierte Drug-Delivery-Systeme bieten konnte. Dieses Manuskript stellt einige einfache und schnelle Experimente in Bezug auf die zelluläre Aufnahme von [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-II und [Lys 8 (FITC)] – GnRH -III auf der EBC-1 (Lunge), die BxPC-3 (Pankreas) und auf der Detroit-562- (Pharynx) maligne tumor Zellen. Parallel zu diesen GnRH-FITC-Konjugate wurde die Zelloberflächenpegel von GnRH-I-Rezeptoren auch auf diese Zelllinien untersucht vor und nach der Behandlung durch GnRH konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie. Die zelluläre Aufnahme von GnRH-FITC-Konjugate wurde durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung quantifiziert. In diesen Experimenten geringfügige Unterschiede zwischen den GnRH-Analoga und die wichtigsten Unterschiede zwischen den Zelltypen beobachtet. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Zelllinien sind mit ihrer ausgeprägten Maß an Zelloberflächen-GnRH-I-Rezeptoren korreliert. Die vorgestellten Experimente enthalten praktische Methoden zu visualisieren, zu quantifizieren und die Aufnahmeeffizienz von GnRH-FITC-Konjugate in einer zeit- und konzentrationsabhängigen Art und Weise auf verschiedenen adhärenten Zellkulturen vergleichen. Diese Ergebnisse könnten die Drug-Targeting-Effizienz von GnRH-Konjugate auf der gegebenen Zellkultur vorhersagen, und bieten eine gute Grundlage für weitere Experimente bei der Untersuchung von GnRH-basierte Drug-Delivery-Systeme.
Introduction
Peptid – basierten gezielten Wirkstoffabgabesysteme haben eine schnelle Entwicklung und vielversprechender Bereich in der Krebstherapie in den letzten Jahren zu 1, 2. Menschliche Gonadotropin – Releasing – Hormon – Rezeptor Typ I (GnRH-IR) wird in erster Linie in der Hypophyse befindet , sondern auch in verschiedenen anderen Geweben , die für die Selbstreproduktion 3 verantwortlich sind. GnRH-IR ist auch in einer Reihe von Krebsgewebe, im Zusammenhang oder in keinem Zusammenhang mit dem Fortpflanzungssystem 4, 5 ausgedrückt. Die hohe Expression von GnRH-IR bei verschiedenen malignen Tumorzellen im Vergleich zu gesunden Geweben bietet die Möglichkeit für eine zielgerichtete Therapie 5, 6.
Viele Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) Analoga wurden in den letzten Jahrzehnten entwickelt, die als Targeting-Einheiten verwendet werden könnte,f "> 7, 8, 9. Diese Peptide sind in der Lage Antikrebsmittel mit hoher Selektivität in maligne Tumorzellen zu liefern , die überexprimieren GnRH-IR 6. Mehrere GnRH konjugierten anti-Tumor – Arzneimittel mit höherer Selektivität und eine bessere Wirksamkeit als das entsprechende nicht – konjugiertem freie Arzneimittel wurden 7 berichtet, 8, 9.
Zurück Publikationen zu GnRH – Peptide und deren Rezeptoren berichtet , dass die GnRH-IR verschiedene Konformationen annehmen kann , die unterschiedliche Selektivität für GnRH – Analoga 10. Die hochvariable GnRH-IR ist komplex und verschiedene Signalwege mit unterschiedlichen Aktivität gegen ihre natürlichen und künstlichen Liganden 11 dotiert. Diese Tatsachen machen Untersuchung von GnRH-basierte Systeme eine Herausforderung. Auf der anderen Seite, die y besitzen vielversprechendes therapeutisches Potential. Mehrere Experimente mit radioaktiv markierten GnRH – Peptide zuvor 12 gemeldet wurden, 13, 14, 15, aber Versuche , bei denen fluoreszenzmarkierte wurden GnRH – Analoga verwendet werden , sind noch begrenzt. Während die radioaktive Markierung eine hohe Empfindlichkeit bietet, hat die Fluoreszenzmarkierung einige andere Vorteile, beispielsweise die einfachere Handhabung und die Möglichkeit, mit unterschiedlichen Fluorophoren Gegenfärbung. Drei gemeinsame GnRH – Analoga , die erfolgreich für die Arzneimittelzufuhr verwendet wurden , sind die [D-Lys 6] -GnRH-I, [D-Lys 6] -GnRH-II und GnRH-III, aber die Wirksamkeit dieser Peptide als Targeting – Einheiten ist , selten 16 verglichen wird , 17. Auf der anderen Seite ergibt sich aus verschiedenen Experimenten, in denen verschiedene Krebszellen und GnRH-Analoga verwendet wurden, ist vielfältig.
ntent "> Basierend auf diesen Überlegungen konzentrierten wir uns auf die Tumor – Targeting und Arzneimittelabgabepotential dieser GnRH – Peptiden und dadurch synthetisiert und charakterisiert den [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] – GnRH-II und [Lys 8 (FITC)] – GnRH-III 18 – Peptid – Konjugate dieser Analoga sind mit FITC an der Seitenkette ihrer Lys oder D-Lys (Peptid-FITC Verhältnis 1 selektiv markiert: 1 bei jedem. Konjugat). die Idee war, dass die selektive Fluoreszenzmarkierung neue Informationen über diese Peptide bieten können, und ermöglicht ihre gute Tracking und zuverlässige Quantifizierung. Diese Konjugate haben eine sichere Handhabung und zuverlässige Erkennbarkeit, die es einfacher machen, ihre Tumor-Targeting die Effizienz zu vergleichen, und die Screening von zahlreichen Arten von bösartigen Tumorzellen. Wir hoffen, dass auf dem neuesten Stand Experimente mit diesen Peptid-Konjugate auf die Entwicklung neuer Krebs beitragen könnten, GnRH-Wirkstoff-Konjugate Targeting und dazu beitragen, neue therapeutische Teer zu identifizierenals auch bekommt.Die vorliegende Manuskript zeigt einige gut reproduzierbare und schnelle Experimente mit GnRH-FITC-Konjugate. Die Zelloberflächenexpression von GnRH-R ist eine bestimmend Bedingung hinsichtlich GnRH-Aufnahme, daher gleichzeitig wir die Zelloberflächenniveau GnRH-IR auf den getesteten Zelllinien untersucht. Wir visualisiert die GnRH-IR und GnRH-FITC-Konjugate durch konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM) und quantifiziert die zelluläre Aufnahme von GnRH-FITC-Konjugate unter Verwendung von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin beschriebenen Experimente selektiv markierten GnRH-Analoga für das Screening adhärenten verwenden Zellkulturen in vitro. Konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie Methoden geeignet sind zum Verfolgen und Quantifizierung der zellulären Aufnahme dieser GnRH-FITC-Konjugate in einer zeit- und konzentrationsabhängigen Art und Weise. Diese Experimente haben die folgenden kritischen Schritte: 1) halten eine sterile, gesunde Zellkultur; 2) GnRH Peptide müssen von hoher Qualität sein; 3) an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).
Materials
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
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