במבחנה הדמיה וכימות של יעילות מיקוד והתרופות של אנלוגים של GnRH שכותרתו fluorescently
Summary
GnRH-I ניאון שכותרתו סלקטיבי, -II ו -III נגזרים הם כלי אמין עבור מעקב וכימות ספיגת הסלולר שלהם. כתב יד זה מציג ניסויים כדי להמחיש, לכמת ולהשוות את היעילות הספיגה של conjugates GnRH אלה שורות תאים שונות.
Abstract
אנלוגים של GnRH הם moieties מיקוד יעיל ומסוגל לספק סוכני נגד סרטן באופן סלקטיבי לתוך תאים סרטניים ממאירים אשר מאוד קולטני GnRH מפורשת. עם זאת, ניתוח כמותי של ספיגת הסלולר 'אנלוגים של GnRH ואת סוגי התאים נחקרו מערכות אספקת סמי GnRH המבוסס מוגבלים בשלב זה. בעבר הציגו, ניאון שכותרתו סלקטיבי GnRH לי, -II ו -III נגזר לספק detectability הגדול, ויש להם תכונות כימיות מתאימות לניסוי לשחזור ויציב. גם מצאנו כי שיטות עַדכָּנִי המתאימות עם אנלוגים של GnRH שכותרתו אלה יכולים להציע מידע רומן על מערכות אספקת סמים מבוססים GnRH. כתב יד זה מציג כמה ניסויים פשוטים ומהירים לגבי ספיגת הסלולר של [D-ליס 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-ליס 6 (FITC)] – GnRH-II ו [ליס 8 (FITC)] – GnRH -III על EBC-1 (ריאות), את BxPC-3 (לבלב) ועל t ממאיר דטרויט-562- (הלוע)תאי umor. במקביל conjugates GnRH-FITC הללו, הרמה פני התא של קולטני GnRH-נבדקה גם על שורות תאים אלה לפני ואחרי טיפול GnRH ידי מיקרוסקופ סריקת ליזר confocal. ספיגת הסלולר של conjugates GnRH-FITC הייתה לכמת ידי מיון תא מופעל קרינה. בניסויים אלו הבדלים קלים בין אנלוגים של GnRH ואת ההבדלים עיקריים בין סוגי תאים נצפו. ההבדלים המשמעותיים בין שורות תאים מתואמים עם הרמה המובחנת של קולטני תא משטח GnRH-I. הניסויים הציגו לכלול שיטות מעשיות לדמיין, לכמת ולהשוות את היעילות הספיגה של conjugates GnRH-FITC בתוך הזמן- ואופן ריכוז-תלויים בתרביות תאים חסידות שונות. תוצאות אלו יכולות לחזות את יעילות מיקוד התרופה של conjugates GnRH על תרבית תאים הנתונה, ומציעות בסיס טוב עבור ניסויים נוספים בבדיקת מערכות אספקת סמים מבוסס GnRH.
Introduction
פפטיד מערכות מבוססות שיגור תרופות הפכו פיתוח מהיר תחום מבטיח בטיפול בסרטן על 1 בשנים האחרונות, 2. סוג קולטן גונדוטרופין אדם ההורמון משחרר לי (GnRH-IR) ממוקם בעיקר בבלוטת יותרת המוח אך הוא מופיע גם בכמה רקמות אחרות אשר אחראים עצמי רבייה 3. GnRH-IR מתבטא גם במספר רקמות סרטן, הקשורים או שאינם קשורים במערכת הרבייה 4, 5. הביטוי הגבוה של GnRH-IR בכמה תאים סרטניים ממאירים לעומת רקמות בריאות מספק הזדמנות עבור טיפול ממוקד 5, 6.
הורמון גונדוטרופין משחררים רב (GnRH) אנלוגים פותחו בעשורים האחרונים, אשר יכול לשמש מיקוד moietiesf "> 7, 8, 9. פפטידים אלה מסוגלים לספק סוכנים אנטי סרטניים עם סלקטיביות גבוהה לתוך תאים סרטניים ממאירים אשר על-Express 6 GnRH-IR. תרופות אנטי סרטניות מספר מצומדות GnRH עם סלקטיביות גבוהה ויעיל יותר מאשר מקביל unconjugated תרופה ללא תשלום דווחה 7, 8, 9.
פרסומים קודמים על פפטידים GnRH ואת הקולטנים שלהם דיווחו כי GnRH-IR ניתן להניח תצורות שונות אשר יש סלקטיביות שונה עבור GnRH אנלוגים 10. GnRH-IR משתנה מאוד יש מסלולי איתות מורכבים ומגוונים ניחן פעילות שונים נגד ליגנדים טבעיים ומלאכותיים שלהם 11. עובדות אלו הופכות חקירה של מערכות מבוססות GnRH מאתגרת. מצד שני, את y בעלי פוטנציאל טיפולי מבטיח. כמה ניסויים עם פפטידים radiolabeled GnRH דווחו בעבר 12, 13, 14, 15, אך ניסויים שבהם שכותרתו fluorescently אנלוגים של GnRH שימשו עדיין מוגבל. בעוד סימון הרדיואקטיבי מציע רגישות גבוהה, תיוג פלורסנט יש יתרונות נוספים, למשל טיפול הקל, ואת יכולת counterstain עם fluorophores השונה. שלושה אנלוגים של GnRH נפוצה אשר שימשו בהצלחה עבור משלוח הסמים הם [D-ליס 6] -GnRH-I, [D-ליס 6] -GnRH-II ו- GnRH-III, אך האפקטיביות של פפטידים אלה moieties מיקוד לעתים רחוקות לעומת 16, 17. מצד השני, תוצאות מניסויים נפרדים שבו תאים סרטניים שונים אנלוגים של GnRH שמשו מגוונת.
ntent "> בהתבסס על שיקולים אלה, התמקדנו הגידול מיקוד ופוטנציאל משלוח סמים של פפטידים GnRH אלה, מסונתז ובכך ואפיין את [D-ליס 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-ליס 6 (FITC ]) – GnRH-II ו [8 ליס (FITC)] – conjugates פפטיד GnRH-III 18 אנלוגים אלו מסומנים באופן סלקטיבי עם FITC על שרשרת הצד של ליס או D-ליס (פפטיד-FITC שלהם יחס 1: 1 בכל. המצומד). הרעיון היה כי תיוג פלורסנט סלקטיבי יכול להציע מידע רומן על פפטידים אלה, ומאפשר מעקב שלהם טוב וכימות אמין. יש הטיות אלה טיפול בטוח ויכולת גילוי אמין, אשר עושים את זה קל יותר להשוות יעילות מיקוד הגידול שלהם, ואת הקרנת סוגים רבים של תאים סרטניים ממאירים. אנו מקווים כי עד-כדי ניסויי תאריך עם conjugates פפטיד אלה יכולים לתרום להתפתחות של סרטן רומן מיקוד conjugates סמי GnRH, ולעזור לזהות זפת טיפולית חדשהמקבל גם כן.כתב היד הנוכחי מדגים כמה ניסויים לשחזור מהיר גם עם conjugates GnRH-FITC. הביטוי שטח פני התא של GnRH-R הוא מצב מכריע לגבי ספיגת GnRH, ולכן אנחנו במקביל בודקים את הרמה פני התא של GnRH-IR על שורות תאים הנבדקות. אנו לנגד עיניו את conjugates GnRH-IR ו- GnRH-FITC ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM) לכמת את ספיגת הסלולר של conjugates GnRH-FITC באמצעות תא הקרינה מיון מופעל (FACS).
Protocol
Representative Results
Discussion
הניסויים שתוארו במסמך להשתמש אנלוגים של GnRH שכותרתו סלקטיבי עבור חסיד ההקרנה בתרביות תאים במבחנה. מיקרוסקופיה Confocal וזרימת cytometry שיטות יכולות לשמש למעקב לכימות ספיגת הסלולר של conjugates GnRH-FITC אלה בתוך זמן ואופן ריכוז תלוי. יש ניסויים אלה השלבים הקריטיים הבאים: 1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).
Materials
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
- Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11 (2016).
- Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
- Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues. Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).
- Schally, A. V., et al. Hypothalamic hormones and cancer. Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).
- Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
- Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
- Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
- Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
- Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
- Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -. L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
- Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
- Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
- Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
- Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
- Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists – A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
- Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
- Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
- Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).
