In Vitro Imaging et la quantification de l'efficacité de ciblage des médicaments d'Analogues GnRH marqué par fluorescence

Summary

Sélectivement marqué fluorescent GnRH-I, -II et -III dérivés sont des outils fiables pour le suivi et la quantification de leur absorption cellulaire. Ce manuscrit présente des expériences pour visualiser, quantifier et comparer l'efficacité d'absorption de ces conjugués de GnRH dans diverses lignées cellulaires.

Abstract

analogues de la GnRH sont des fragments de ciblage efficaces et capables de délivrer des agents anti-cancéreux de manière sélective dans des cellules tumorales malignes qui expriment fortement les récepteurs de la GnRH. Cependant, l'analyse quantitative de l'absorption cellulaire des analogues de la GnRH et les types cellulaires étudiés dans les systèmes de délivrance de médicaments à base de GnRH sont actuellement limitées. Auparavant introduit, marqué par fluorescence sélective GnRH I, -II et -III dérivés fournir une grande détectabilité, et ils ont des propriétés chimiques appropriés pour des expériences reproductibles et robustes. Nous avons également constaté que les méthodes mises à jour appropriées avec ces analogues de la GnRH marqués pourraient offrir des informations inédites sur les systèmes de délivrance de médicaments à base de GnRH. Ce manuscrit présente quelques expériences simples et rapides en ce qui concerne l'absorption cellulaire de [D-Lys ⁶ (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC)] – GnRH-II et [Lys ⁸ (FITC)] – GnRH -III sur l'EBC-1 (poumon), le BxPC-3 (pancréas) et sur le Detroit 562- (pharynx) t malignesumor cellules. Parallèlement à ces conjugués au FITC GnRH, le niveau des récepteurs de la GnRH-I de surface cellulaire a également été examinée sur ces lignées cellulaires avant et après le traitement à la GnRH par microscopie confocale à balayage laser. L'absorption cellulaire des conjugués de GnRH-FITC a été quantifié par tri cellulaire activé par fluorescence. Dans ces expériences, des différences mineures entre les analogues de la GnRH et de grandes différences entre les types de cellules a été observée. Les différences significatives entre les lignées cellulaires sont mises en corrélation avec leur niveau distinct de récepteurs de surface cellulaire GnRH-I. Les expériences présentées contiennent des méthodes pratiques pour visualiser, quantifier et comparer l'efficacité de l'absorption de conjugués GnRH-FITC dans un temps et de manière dépendante de la concentration sur les différentes cultures de cellules adhérentes. Ces résultats pourraient prédire l'efficacité des médicaments ciblant des conjugués GnRH sur la culture cellulaire donné, et d'offrir une bonne base pour d'autres expériences dans l'examen des systèmes de délivrance de médicaments à base de GnRH.

Introduction

Systèmes de délivrance de médicaments peptidiques à base ciblées sont devenues un développement rapide et domaine prometteur dans le traitement du cancer au cours des dernières années ^{1, 2.} La gonadotrophine humaine de type récepteur d'hormone de libération de I (GnRH-IR) est principalement situé dans la glande pituitaire , mais est aussi présent dans plusieurs autres tissus qui sont responsables de l' autoreproduction ^3. GnRH-IR est également exprimée dans de nombreux tissus cancéreux, liés ou non au système reproducteur ^{4, 5.} L'expression élevée de GnRH-IR sur plusieurs cellules tumorales malignes par rapport aux tissus sains est l'occasion pour la thérapie ciblée ^{5, 6.}

Beaucoup gonadolibérine (GnRH) analogues ont été développés au cours des dernières décennies, qui pourraient être utilisés comme groupements de ciblagef "> ^{7, 8, 9.} Ces peptides sont capables de délivrer des agents anticancéreux avec une sélectivité élevée dans les cellules tumorales malignes qui surexpriment GnRH-IR ^6. Plusieurs médicaments anti-tumoraux conjugués GnRH avec une sélectivité plus élevée et une meilleure efficacité que le non conjugué correspondant sans drogue ont été signalés ^{7, 8, 9.}

Les publications précédentes au sujet de peptides GnRH et leurs récepteurs ont indiqué que le GnRH-IR peut prendre différentes conformations qui ont sélectivité différente pour GnRH analogues de ^10. La GnRH-IR très variable a des voies de signalisation complexes et diverses sont dotés d' une activité différente contre leurs ligands naturels et artificiels ^11. Ces faits font enquête sur les systèmes basés sur la GnRH difficile. D'autre part, la y possèdent un potentiel thérapeutique prometteur. Plusieurs expériences avec des peptides GnRH radiomarqués ont été signalés précédemment ^{12, 13, 14, 15,} mais des expériences dans lesquelles analogues de la GnRH marqués par fluorescence ont été utilisés sont encore limitées. Bien que le marquage radioactif offre une sensibilité élevée, un marquage fluorescent a plusieurs autres avantages, par exemple la manipulation plus facile, et la capacité de contre-colorer avec des fluorophores différents. Trois analogues de la GnRH communes qui ont été utilisées avec succès pour la délivrance de médicaments sont le [D-Lys ^6] -GnRH-I, [D-Lys ^6] -GnRH-II et GnRH-III, mais l'efficacité de ces peptides comme fragments de ciblage est rarement contre ^{16, 17.} D'autre part, les résultats d'expériences distinctes dans lesquelles des cellules cancéreuses différentes et des analogues de la GnRH ont été utilisés sont divers.

MÉNAGEMENT "> Sur la base de ces considérations, nous nous sommes concentrés sur le ciblage de la tumeur et le potentiel de distribution de médicaments de ces peptides de la GnRH et, par conséquent synthétisé et caractérisé par la [D-Lys ⁶ (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC )] – GnRH-II et [Lys ⁸ (FITC)] – peptides conjugués GnRH-III ¹⁸ Ces analogues sont sélectivement marqués par la FITC sur la chaîne latérale de la Lys ou D-Lys (rapport peptide-FITC 1: 1 à chacun. conjugué). l'idée était que le marquage fluorescent sélectif peut offrir des informations inédites sur ces peptides, et permet leur bonne suivi et une quantification fiable. ces conjugués ont une manipulation sûre et détectabilité fiable, ce qui rend plus facile de comparer leur tumeur efficacité du ciblage, et projection de nombreux types de cellules tumorales malignes. Nous espérons que la mise à jour des expériences avec ces conjugués peptidiques pourrait contribuer au développement de nouveaux cancer ciblant conjugués GnRH-médicaments, et d'aider à identifier de nouvelles tar thérapeutiqueobtient ainsi.

Le présent manuscrit démontre quelques expériences bien reproductibles et rapides avec des conjugués GnRH-FITC. L'expression de surface cellulaire de la GnRH-R est une condition déterminante en ce qui concerne l'absorption de la GnRH, par conséquent, nous avons étudié simultanément le niveau de la GnRH-IR à la surface cellulaire sur les lignées cellulaires testées. Nous avons visualisé les conjugués GnRH-IR et GnRH-FITC par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et quantifié l'absorption cellulaire des conjugués de GnRH-FITC en utilisant les cellules activées par fluorescence (FACS).

Protocol

1. Préparation des cultures de cellules et réactifs Maintenir les cultures de cellules dans le milieu recommandé par le fabricant, supplémenté avec 10% (v / v) de sérum et d'antibiotiques de veau fœtal (milieu appelé complet). Maintenir la fiole de culture de cellules dans un humidifiée à 5% de CO 2 atmosphère incubateur à 37 ° C. Suivre la prolifération et la confluence des cellules au microscope inversé (en utilisant l'objectif 10X de contraste de phase). Lorsque …

Representative Results

Les images obtenues par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) offrent de l'information spectaculaire l'absorption de conjugués GnRH-FITC sur la culture cellulaire donnée dans un temps et d'une manière dépendante de la concentration. Parallèlement à ces conjugués au FITC GnRH, la présence de la GnRH-IR sur la surface cellulaire est également vérifiée par l'expérience CLSM. En outre, en utilisant une coloration de l'ADN sonde fluorescente rouge loin…

Discussion

Les expériences décrites ici utiliser analogues de la GnRH marqués sélectivement pour le dépistage adhérent des cultures de cellules in vitro. La microscopie confocale et cytométrie de flux méthodes sont appropriées pour le suivi et la quantification de l'absorption cellulaire de ces conjugués de GnRH-FITC en un temps et d'une manière dépendante de la concentration. Ces expériences ont les étapes essentielles suivantes: 1) maintenir une culture cellulaire stérile, en bonne sant…

Materials

EBC-1	JCRB Cell Bank	JCRB0820	Human lung squamous cell carcinoma
BxPC-3	ATCC	CRL-1687	Human pancreatic adenocarcinoma
Detroit-562	ATCC	CCL-138	Human pharyngeal carcinoma
RPMI-1640 Medium with L-glutamine	Lonza	BE12-702F	Culture medium for BxPC-3 cells
Eagle's Minimum Essential Medium	Lonza	BE12-611F	Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells
Fetal Bovine Serum	Euro Clone	ECS0180L	Complements the culture medium
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2012	Complements the culture medium (antibiotics)
Standard Line Cell Culture Flasks	VWR	10062-872	Provide consistent, sterile growth environment for cells
Trypsin-EDTA Mixture	Lonza	BE17-161E	Remove attached cells
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Lonza	BE17-516F	Solvent
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	Solvent
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	Used to counting cells
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I	made by us	–	Purity ≥98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II	made by us	–	Purity ≥98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-III	made by us	–	Purity ≥98% (HPLC)
glass bottom 8-well microscopic slide	Ibidi	80826	Use in CLSM experiment
Corning Costar cell culture plate, 12 well	Sigma-Aldrich	CLS3513-50EA	Use in FACS experiment
Fixing solution (10% neutral buffered formalin)	Bio-Optica	01V60P	Fix adherent cells
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G	Prevent the nonspecific binding of the antibodies
GnRHR Antibody	Proteintech	19950-1-AP	Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors
Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A11035	Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody
Fluorescent probe solution (Draq5)	Thermo Fisher Scientific	62254	Counterstain nuclei
Fluoromount Aqueous Mounting Medium	Sigma-Aldrich	F4680-25ML	Use in CLSM experiment, preserving fluorescence
Inverted microscope	Elektro-Optika Ltd.	Alpha XDS-2T	Check the phenotype and confluency of cell cultures
Inverted confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM-710	Use in CLSM experiment
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur	Use in FACS experiment