In Vitro Imaging e quantificazione della Drug Targeting efficienza di fluorescente GnRH analoghi

Summary

Selettivamente l'etichetta fluorescente GnRH-I, -II e -III derivati sono strumenti affidabili per il monitoraggio e la quantificazione loro assorbimento cellulare. Questo manoscritto introduce esperimenti di visualizzare, quantificare e confrontare l'efficienza di assorbimento di questi coniugati GnRH in diverse linee cellulari.

Abstract

analoghi del GnRH sono efficaci frazioni di targeting e in grado di fornire agenti antitumorali selettivamente nelle cellule tumorali maligne che i recettori del GnRH altamente espresso. Tuttavia, l'analisi quantitativa di assorbimento cellulare GnRH analoghi 'ei tipi di cellule indagati in sistemi di drug delivery GnRH-based sono attualmente limitati. In precedenza introdotto, fluorescente selettivamente etichettato GnRH I, -II e -III derivati ​​fornire grande rilevabilità, e hanno gli immobili chimici per esperimenti riproducibili e robusti. Abbiamo anche trovato che i metodi appropriati up-to-date con questi analoghi del GnRH etichettati potrebbero offrire nuove informazioni sui sistemi di somministrazione dei farmaci a base di GnRH. Questo manoscritto introduce alcuni esperimenti semplici e veloci per quanto riguarda l'assorbimento cellulare di [D-Lys ⁶ (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC)] – GnRH-II e [Lys ⁸ (CIC)] – GnRH -III sulla EBC-1 (polmone), la BxPC-3 (pancreas) e sul Detroit-562- (faringe) maligno tumor cellule. Parallelamente a queste coniugati GnRH-FITC, il livello della superficie cellulare dei recettori GnRH-I è stato esaminato anche su queste linee cellulari, prima e dopo il trattamento GnRH dal microscopio confocale a scansione laser. L'assorbimento cellulare di coniugati GnRH-FITC è stato quantificato con la fluorescenza-attivato l'ordinamento delle cellule. In questi esperimenti è stata osservata piccole differenze tra analoghi del GnRH e le principali differenze tra i tipi di cellule. Le differenze significative tra le linee cellulari sono correlati con il loro livello distinto di recettori di superficie delle cellule GnRH-I. Gli esperimenti introdotti contengono metodi pratici per visualizzare, quantificare e confrontare l'efficienza di assorbimento di coniugati GnRH-FITC in un tempo e modo dipendente dalla concentrazione su varie colture cellulari aderenti. Questi risultati potrebbero prevedere il drug targeting efficienza dei coniugati GnRH sulla data coltura cellulare, e di offrire una buona base per ulteriori esperimenti in esame dei sistemi di somministrazione dei farmaci a base di GnRH.

Introduction

Sistemi di drug delivery mirati a base di peptidi sono diventati un rapido sviluppo e la zona promettente nella terapia del cancro negli ultimi anni ^{1, 2.} Gonadotropina umana di tipo rilasciando recettore dell'ormone I (GnRH-IR) si trova principalmente nella ghiandola pituitaria, ma è presente anche in molti altri tessuti che sono responsabili per l'auto-riproduzione ^3. GnRH-IR si esprime anche in un certo numero di tessuti tumorali, collegate o indipendenti per il sistema riproduttivo ^{4, 5.} L'elevata espressione di GnRH-IR in diverse cellule tumorali maligne rispetto ai tessuti sani prevede la possibilità per la terapia mirata ^{5, 6.}

Molti dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) analoghi sono stati sviluppati negli ultimi decenni, che potrebbero essere utilizzati come target porzionif "> ^{7, 8, 9.} Questi peptidi sono in grado di rilasciare agenti antitumorali con elevata selettività in cellule tumorali maligne che over-esprimono GnRH-IR ^6. Diversi GnRH farmaci anti-tumorali coniugati con elevata selettività e migliore efficienza rispetto al corrispondente coniugato droga libera sono stati segnalati ^{7, 8, 9.}

Precedenti pubblicazioni su peptidi GnRH e dei loro recettori hanno riferito che il GnRH-IR può assumere diverse conformazioni che hanno selettività diverso per GnRH analoghi della ^10. Il GnRH-IR altamente variabile ha vie di segnalazione complesse e varie sono dotati di diversa attività contro i loro ligandi naturali e artificiali ^11. Questi fatti fanno indagini di sistemi basati su GnRH impegnativo. D'altra parte, la y possiedono potenziale terapeutico promettente. Diversi esperimenti con peptidi radiomarcati GnRH sono stati precedentemente riportati ^{12, 13, 14, 15,} ma esperimenti in cui sono stati usati gli analoghi del GnRH fluorescente sono ancora limitate. Mentre marcatura radioattiva offre alta sensibilità, marcatura fluorescente ha diversi altri vantaggi, ad esempio la maneggevolezza e la capacità di colorazione di contrasto con differenti fluorofori. Tre analoghi del GnRH comuni che sono stati usati con successo per somministrazione di farmaci sono i [D-Lys ^6] -GnRH-I, [D-Lys ^6] -GnRH-II e III-GnRH, ma l'efficacia di questi peptidi come porzioni di targeting è raramente rispetto ^{16, 17.} D'altro canto, i risultati di esperimenti separati in cui sono stati utilizzati differenti cellule tumorali e analoghi GnRH è varia.

S copi "> Sulla base di queste considerazioni, si concentra sul tumore targeting e potenziale drug delivery di questi peptidi GnRH, e così sintetizzato e caratterizzato [D-Lys ⁶ (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC )] – GnRH-II e [Lys ⁸ (FITC)] – GnRH-III coniugati peptide ¹⁸ Questi analoghi sono selettivamente etichettati con FITC sulla catena laterale di loro (rapporto peptide-FITC Lys o D-Lys 1: 1 in ogni. coniugato). l'idea era che l'etichettatura fluorescente selettivo in grado di offrire nuove informazioni su questi peptidi, e permette loro buon monitoraggio e la quantificazione affidabile. questi coniugati hanno una manipolazione sicura e rilevabilità affidabile, che rendono più facile per confrontare il loro tumore efficienza targeting e la proiezione di numerosi tipi di cellule tumorali maligne. speriamo che fino a esperimenti data con questi coniugati peptide potrebbe contribuire allo sviluppo del cancro romanzo mira coniugati GnRH-droga, e contribuire ad individuare nuove tar terapeuticoottiene pure.

Il presente manoscritto dimostra alcuni esperimenti ben riproducibili e veloci con coniugati GnRH-FITC. L'espressione superficie cellulare di GnRH-R è una condizione determinante per quanto riguarda l'assorbimento del GnRH, quindi abbiamo studiato contemporaneamente il livello della superficie cellulare di GnRH-IR sulle linee cellulari testate. Abbiamo visualizzato il coniugati GnRH-IR e GnRH-FITC da confocale a scansione laser microscopia (CLSM) e quantificato l'assorbimento cellulare di coniugati GnRH-FITC utilizzando celle a fluorescenza-attivato (FACS).

Protocol

1. Preparazione di colture cellulari e reagenti Mantenere le colture cellulari in terreno raccomandato dal produttore, supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino e antibiotici (chiamato mezzo completo). Mantenere il matraccio di coltura cellulare in un umidificata, 5% un'atmosfera incubatore CO 2 a 37 ° C. Seguire la proliferazione e la confluenza delle cellule mediante microscopio invertito (utilizzando 10X obiettivo contrasto di fase). Quando le cellule raggiungono un ade…

Representative Results

Le immagini ottenute mediante scansione laser confocale microscopio (CLSM) offrono informazioni spettacolare circa l'assorbimento di coniugati GnRH-FITC sulla data coltura cellulare in un tempo e concentrazione modo dipendente. In parallelo con questi coniugati GnRH-FITC, la presenza del GnRH-IR sulla superficie cellulare è anche verificabile dall'esperimento CLSM. Inoltre, utilizzando una sonda fluorescente colorazione DNA rosso lontano, è possibile colorazione di contrasto nu…

Discussion

Gli esperimenti descritti nel presente documento utilizzare analoghi del GnRH selettivamente etichettati per lo screening aderenti colture cellulari in vitro. La microscopia confocale e citometria a flusso metodi sono adatti per il monitoraggio e la quantificazione l'assorbimento cellulare di questi coniugati GnRH-FITC in un tempo e concentrazione modo dipendente. Questi esperimenti hanno i seguenti passaggi critici: 1) mantenere una cultura di cellule sane sterili; 2) peptidi GnRH devono essere …

Materials

EBC-1	JCRB Cell Bank	JCRB0820	Human lung squamous cell carcinoma
BxPC-3	ATCC	CRL-1687	Human pancreatic adenocarcinoma
Detroit-562	ATCC	CCL-138	Human pharyngeal carcinoma
RPMI-1640 Medium with L-glutamine	Lonza	BE12-702F	Culture medium for BxPC-3 cells
Eagle's Minimum Essential Medium	Lonza	BE12-611F	Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells
Fetal Bovine Serum	Euro Clone	ECS0180L	Complements the culture medium
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2012	Complements the culture medium (antibiotics)
Standard Line Cell Culture Flasks	VWR	10062-872	Provide consistent, sterile growth environment for cells
Trypsin-EDTA Mixture	Lonza	BE17-161E	Remove attached cells
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Lonza	BE17-516F	Solvent
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	Solvent
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	Used to counting cells
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I	made by us	–	Purity ≥98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II	made by us	–	Purity ≥98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-III	made by us	–	Purity ≥98% (HPLC)
glass bottom 8-well microscopic slide	Ibidi	80826	Use in CLSM experiment
Corning Costar cell culture plate, 12 well	Sigma-Aldrich	CLS3513-50EA	Use in FACS experiment
Fixing solution (10% neutral buffered formalin)	Bio-Optica	01V60P	Fix adherent cells
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G	Prevent the nonspecific binding of the antibodies
GnRHR Antibody	Proteintech	19950-1-AP	Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors
Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A11035	Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody
Fluorescent probe solution (Draq5)	Thermo Fisher Scientific	62254	Counterstain nuclei
Fluoromount Aqueous Mounting Medium	Sigma-Aldrich	F4680-25ML	Use in CLSM experiment, preserving fluorescence
Inverted microscope	Elektro-Optika Ltd.	Alpha XDS-2T	Check the phenotype and confluency of cell cultures
Inverted confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM-710	Use in CLSM experiment
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur	Use in FACS experiment