In Vitro Imaging and Quantificação da segmentação Eficiência Drogas de análogos de GnRH fluorescente etiquetado

Summary

Selectivamente marcado fluorescente GnRH-I, -II e -III derivados são ferramentas confiáveis para acompanhar e quantificar a sua captação celular. Este manuscrito apresenta experiências para visualizar, quantificar e comparar a eficiência de absorção destes conjugados da GnRH em várias linhas celulares.

Abstract

análogos de GnRH são porções de direccionamento eficaz e capaz de entregar agentes anticancerígenos seletivamente em células tumorais malignas quais os receptores GnRH altamente expresso. No entanto, a análise quantitativa de captação celular análogos de GnRH 'e os tipos de células investigadas em sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH são actualmente limitada. Previamente introduzido, fluorescente marcado selectivamente GnRH I, -II e -III derivados fornecem grande detectabilidade, e eles têm propriedades químicas adequadas para experiências reprodutíveis e robustas. Descobrimos também que os métodos apropriados up-to-date com estes análogos de GnRH rotulados poderia oferecer novas informações sobre os sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH. Este manuscrito apresenta algumas experiências simples e rápido sobre a absorção celular de ^[D-Lys6 (FITC)] – a GnRH-I, ^[D-Lys6 (FITC)] – a GnRH-II e [Lys ⁸ (FITC)] – GnRH -III na EBC-1 (pulmão), o BxPC-3 (pâncreas) e na Detroit-562- (faringe) T malignaUmor células. Em paralelo com estes conjugados da GnRH-FITC, o nível da superfície celular de receptores de GnRH-I também foi examinada com estas linhas de células antes e após o tratamento com GnRH por microscopia confocal de varrimento laser. A absorção celular de conjugados da GnRH-FITC foi quantificada por separação de células activadas por fluorescência. Nestas experiências foi observada pequenas diferenças entre os análogos do GnRH e as principais diferenças entre os tipos de células. As diferenças significativas entre as linhas de células são correlacionados com o seu nível distinto de receptores de superfície celular GnRH-I. Os experimentos introduzidas contêm métodos práticos para visualizar, quantificar e comparar a eficiência de absorção de conjugados de GnRH-FITC em um tempo e forma dependente da concentração em várias culturas de células aderentes. Esses resultados poderiam predizer a eficácia da segmentação de drogas de conjugados de GnRH na cultura celular dado, e oferecem uma boa base para novas experiências no exame dos sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH.

Introduction

Sistemas de entrega de drogas específicas base de péptidos tornaram-se um desenvolvimento rápido e a área promissor na terapia do cancro ao longo dos últimos anos ^{um, 2.} Gonadotropina humana tipo I libertando receptor da hormona (GnRH-IV) situa-se principalmente na glândula pituitária, mas também está presente em vários outros tecidos que são responsáveis por auto-reprodução ^3. GnRH-IV é também expressa num número de tecidos de cancro, relacionada ou não com o sistema reprodutivo ^{4, 5.} A expressão elevada de GnRH-IR em várias células de tumores malignos em comparação com tecidos saudáveis fornece uma oportunidade para terapia alvo ^{5, 6.}

Muitos hormona libertadora de gonadotropina (GnRH) análogos têm sido desenvolvidos nas últimas décadas, que poderiam ser utilizados como porções de direccionamentof "> ^{7, 8, 9.} Estes péptidos são capazes de entregar agentes anticancerígenos com elevada selectividade para as células tumorais malignas que sobre-expressa a GnRH-IV ^6. Vários fármacos anti-tumorais conjugados da GnRH com maior selectividade e maior eficiência do que o não conjugado correspondendo livre de drogas foram relatados ^{7, 8, 9.}

Publicações anteriores cerca de péptidos da GnRH e seus receptores relatado que a GnRH-IR pode assumir várias conformações diferentes que têm selectividade para GnRH análogos ^10. A GnRH-IR altamente variável tem complexos e várias vias de sinalização são dotados de actividade diferente contra os seus ligandos naturais e artificiais ^11. Estes fatos fazem investigação de sistemas baseados em GnRH desafiador. Por outro lado, o y possuem potencial terapêutico promissor. Várias experiências com péptidos GnRH radiomarcados foram anteriormente relatados ^{12, 13, 14, 15,} mas experimentos nos quais foram usados análogos de GnRH fluorescente etiquetado ainda são limitados. Enquanto marcação radioactiva oferece alta sensibilidade, marcação fluorescente tem várias outras vantagens, por exemplo, o manuseio mais fácil, ea capacidade de contracoloração com diferentes fluoróforos. Três análogos de GnRH comuns que têm sido utilizados com sucesso para a entrega de drogas são a ^[D-Lys6] -GnRH-I, ^[D-Lys6] -GnRH-II e III-GnRH, mas a eficácia destes péptidos como porções de direccionamento é raramente comparado ^{16, 17.} Por outro lado, os resultados obtidos em experiências separadas em que foram utilizadas células de cancro diferentes e os análogos da GnRH é diversa.

ntent "> Com base nestas considerações, nós nos concentramos em que o tumor alvo e potencial de entrega da droga destes péptidos GnRH e, assim, sintetizada e caracterizada a [D-Lys ⁶ (ITCF)] – GnRH-I, [D-Lys ⁶ (FITC )] – a GnRH-II e [Lys ⁸ (FITC)] – conjugados peptídicos de GnRH-III ¹⁸ Estes análogos são marcados selectivamente com FITC na cadeia lateral do seu (razão de péptido-FITC Lys ou D-Lys 1: 1 em cada um. conjugado). a ideia era que a marcação fluorescente seletivo pode oferecer novas informações sobre esses peptídeos, e permite que sua boa localização e quantificação confiável. estes conjugados têm um manuseamento seguro e detecção confiável, o que tornará mais fácil para comparar sua eficiência segmentação tumor, ea triagem de numerosos tipos de células tumorais malignas. esperamos que up-to experimentos data com estes conjugados peptídeo poderia contribuir para o desenvolvimento de câncer de romance alvo conjugados GnRH-drogas, e ajudar a identificar novos tar terapêuticafica bem.

O presente artigo propõe demonstrar algumas experiências bem reprodutíveis e rápidos com conjugados de GnRH-FITC. A expressão na superfície celular da GnRH-R é uma condição determinante sobre a absorção de GnRH, por isso investigado simultaneamente o nível da superfície celular da GnRH-IR sobre as linhas de células testadas. Nós visualizados os conjugados da GnRH-IR e GnRH-FITC por microscopia confocal de varrimento laser (CLSM) e quantificado a absorção celular de conjugados da GnRH-FITC utilizando células activadas por fluorescência (FACS).

Protocol

1. Preparação de Culturas de Células e Reagentes Manter as culturas de células em meio recomendado pelo fabricante, suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino e antibióticos (meio completo chamado). Manter o frasco de cultura de células numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C. Seguir a proliferação de células de confluência e por microscópio invertido (usando 10X objectiva de contraste de fase). Quando as células atingem a confluência adequada, remo…

Representative Results

Imagens obtidas por microscopia confocal de varrimento laser (CLSM) oferecem informações espetacular sobre a absorção de conjugados de GnRH-FITC na cultura de células dada em um tempo e forma dependente da concentração. Em paralelo com estes conjugados da GnRH-FITC, a presença da GnRH-IV na superfície da célula, também é verificável pela experiência CLSM. Além disso, usando uma sonda fluorescente de ADN de coloração vermelho-extremo, é possível contracoloração os nú…

Discussion

As experiências aqui descritas usar análogos de GnRH marcadas seletivamente para o rastreio aderente culturas de células in vitro. A microscopia confocal e métodos de citometria de fluxo são adequados para controlar e quantificar a absorção celular destes conjugados da GnRH-FITC em um momento e de modo dependente da concentração. Estas experiências têm os seguintes passos críticos: 1) manter uma cultura de células estéril e saudável; 2) péptidos GnRH deve ser de elevada qualidade; 3) …

Materials

EBC-1	JCRB Cell Bank	JCRB0820	Human lung squamous cell carcinoma
BxPC-3	ATCC	CRL-1687	Human pancreatic adenocarcinoma
Detroit-562	ATCC	CCL-138	Human pharyngeal carcinoma
RPMI-1640 Medium with L-glutamine	Lonza	BE12-702F	Culture medium for BxPC-3 cells
Eagle's Minimum Essential Medium	Lonza	BE12-611F	Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells
Fetal Bovine Serum	Euro Clone	ECS0180L	Complements the culture medium
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2012	Complements the culture medium (antibiotics)
Standard Line Cell Culture Flasks	VWR	10062-872	Provide consistent, sterile growth environment for cells
Trypsin-EDTA Mixture	Lonza	BE17-161E	Remove attached cells
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Lonza	BE17-516F	Solvent
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	Solvent
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	Used to counting cells
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I	made by us	–	Purity ≥98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II	made by us	–	Purity ≥98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-III	made by us	–	Purity ≥98% (HPLC)
glass bottom 8-well microscopic slide	Ibidi	80826	Use in CLSM experiment
Corning Costar cell culture plate, 12 well	Sigma-Aldrich	CLS3513-50EA	Use in FACS experiment
Fixing solution (10% neutral buffered formalin)	Bio-Optica	01V60P	Fix adherent cells
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-10G	Prevent the nonspecific binding of the antibodies
GnRHR Antibody	Proteintech	19950-1-AP	Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors
Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Thermo Fisher Scientific	A11035	Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody
Fluorescent probe solution (Draq5)	Thermo Fisher Scientific	62254	Counterstain nuclei
Fluoromount Aqueous Mounting Medium	Sigma-Aldrich	F4680-25ML	Use in CLSM experiment, preserving fluorescence
Inverted microscope	Elektro-Optika Ltd.	Alpha XDS-2T	Check the phenotype and confluency of cell cultures
Inverted confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM-710	Use in CLSM experiment
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur	Use in FACS experiment