インビトロイメージングと蛍光標識のGnRH類似体の薬物ターゲティング効率の定量化で
Summary
選択的に標識された蛍光のGnRH-I、-IIおよび-III誘導体は、それらの細胞への取り込みを追跡し、定量化するための信頼性の高いツールです。本稿では、可視化、定量化、および種々の細胞株におけるこれらのGnRHの結合体の取り込み効率を比較するための実験を紹介します。
Abstract
GnRH類似体は、ターゲティング部分、効果的かつ高度にGnRH受容体を発現する悪性腫瘍細胞に選択的に抗癌剤を送達することができます。しかしながら、GnRH類似体」細胞取り込みの定量分析とのGnRHに基づく薬物送達系で調べた細胞型は現在制限されています。先に紹介した、選択的に標識された蛍光のGnRH I、-IIおよび-III誘導体は素晴らしい検出性を提供し、彼らは再現性と堅牢な実験に適した化学的特性を有しています。我々はまた、これらの標識されたGnRH類似体との適切な最新の方法は、のGnRHに基づく薬物送達システムに関する新たな情報を提供できることを見出しました。 GnRH-I、[D-Lysの6（FITC）] – -のGnRH-IIおよび[Lysの8（FITC）] -のGnRHこの原稿は、[D-Lysの6（FITC）]の細胞への取り込みに関するいくつかの簡単かつ迅速に実験を紹介しますEBC-1（肺）に-III、たBxPC-3（膵臓）、デトロイト-562-（咽頭）に悪性トンumor細胞。これらのGnRH-FITCコンジュゲートと並行して、のGnRH-I受容体の細胞表面レベルはまた、共焦点レーザー走査顕微鏡でのGnRH処理前後のこれらの細胞系で調べました。 GnRH-FITCコンジュゲートの細胞取り込みは、蛍光活性化細胞ソーティングにより定量しました。これらの実験でのGnRH類似体および細胞型間の主な相違点間のわずかな違いが観察されました。細胞株の間で有意差は、細胞表面のGnRH-I受容体のそれらの異なるレベルと相関しています。導入された実験では、可視化、定量化、およびさまざまな接着細胞培養物に対する時間および濃度依存的にのGnRH-FITC複合体の取り込み効率を比較するために実用的なメソッドが含まれています。これらの結果は、与えられた細胞培養上のGnRH結合体の薬物ターゲティング効率を予測し、のGnRHに基づく薬物送達システムの検査でさらなる実験のための良い基盤を提供することができます。
Introduction
ペプチドに基づく標的化薬物送達システムは、過去数年1、2にわたって癌治療で急速に発展し、有望な領域となっています。ヒトゴナドトロピン放出ホルモン受容体I型（たGnRH-IR）は、主に脳下垂体に位置するだけでなく、自己再生3を担当しているいくつかの他の組織中に存在します。 GnRH-IRはまた、生殖系4,5に関連または関係のない、癌組織の数で表されます。健常組織と比較して、いくつかの悪性腫瘍細胞上のGnRH-IRの高発現は、標的治療5、6のための機会を提供しています。
多くのゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）類似体は、標的化部分として使用することができる最後の数十年に開発されていますF "> 7、8、9。これらのペプチドは、その過剰発現のGnRH-IR 6悪性腫瘍細胞に選択性の高い抗がん剤を送達することができます。対応する非コンジュゲートよりも高い選択性と優れた効率性を有するいくつかのGnRH結合抗腫瘍薬遊離薬物は、7、8、9を報告されています。
GnRHペプチドとその受容体についての前の出版物はのGnRH-IRはのGnRHは10を類似体に対して異なる選択性を有する様々な立体配座をとることができることを報告しました。非常に可変性のGnRH-IRは、複雑で多様なシグナル伝達経路は、それらの天然と人工のリガンド11に対して異なるアクティビティに恵まれているしています。これらの事実は挑戦のGnRHベースのシステムの調査を行います。一方、 Yは、有望な治療可能性を有します。放射性標識のGnRHペプチドといくつかの実験は、以前に12、13、14、15に報告されたが、蛍光標識されたGnRH類似体が使用された実験はまだ限られている。し放射性標識は高感度を提供していますが、蛍光標識は、いくつかの他の利点、例えば扱いやすく、かつ異なる蛍光体で対比染色する能力を持っています。正常薬物送達のために使用されている3つの一般的なGnRH類似体は、ターゲティング部分として、[D-Lysで6] -GnRH-I、[D-Lysで6] -GnRH-IIとのGnRH-III、これらのペプチドの有効性であるですめったに16、17を比較しません。一方、別の癌細胞およびGnRH類似体が使用された別個の実験からの結果は、多様です。
これらの考察に基づいてntentは">は、これらのGnRHペプチドの腫瘍標的薬物送達の可能性に焦点を当て、それによって合成し、[D-Lysの6（FITC）]特徴付け-のGnRH-I、[D-Lysの6（FITCを）] -のGnRH-IIおよび[Lysの8（FITC）] -のGnRH-IIIペプチド結合体18これらの類似体が選択的にLysまたはD-Lysの側鎖（ペプチド-FITC比1にFITCで標識されています。それぞれに1。コンジュゲート）。アイデアは、選択的蛍光標識は、これらのペプチドについての新たな情報を提供し、それらの良好なトラッキングと信頼性の定量化を可能にすることができるということでした。これらのコンジュゲートは、それが簡単に彼らの腫瘍標的効率を比較することを可能にする安全な取り扱いと信頼性の高い検出能を、持っている、と悪性腫瘍細胞の多くのタイプのスクリーニング。我々は、これらのペプチド複合体とアップへの日付の実験はのGnRH – 薬物複合体を標的とする新たな癌の発展に貢献し、新たな治療タールを識別するために助けることができることを願っています同様になります。現在の原稿はのGnRH-FITCコンジュゲートといくつかのよく再現性と高速実験を示しています。 GnRH-Rの細胞表面発現は、したがって、我々は、同時に試験した細胞株でのGnRH-IRの細胞表面レベルを調べ、のGnRH取り込みに関して決定的な条件です。我々は、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）によってのGnRH-IRとのGnRH-FITC複合体を可視化し、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いたGnRH-FITCコンジュゲートの細胞取り込みを定量化しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に記載した実験は、付着スクリーニングするために選択的に標識されたGnRH類似体を使用します インビトロでの細胞培養物。共焦点顕微鏡および方法は追跡と時間および濃度依存的にこれらのGnRH-FITCコンジュゲートの細胞取り込みを定量化するのに適しているフローサイトメトリー。これらの実験は、以下の重要なステップがあります：1）無菌、健康な細胞培養を維持…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).
Materials
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
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