I vitro Imaging och kvantifiering av det målsökande drog Effektivitet av fluorescerande GnRH-analoger
Summary
Selektivt märkt fluorescerande GnRH-I, -II och -III derivat är tillförlitliga verktyg för spårning och kvantifiering av deras cellulärt upptag. Detta manuskript introducerar experiment för att visualisera, kvantifiera och jämföra upptaget effektiviteten hos dessa GnRH-konjugat i olika cellinjer.
Abstract
GnRH-analoger är effektiva målsökande delar och kunna leverera anticancermedel selektivt i maligna tumörceller som är mycket express GnRH-receptorer. Men kvantitativ analys av GnRH-analoger "cellulärt upptag och de undersökta celltyper i GnRH-baserade läkemedlet leveranssystem för närvarande begränsad. Tidigare infördes, selektivt märkt fluorescerande GnRH I, -II och -III derivat ger stor detekterbarhet, och de har lämpliga kemiska egenskaper för reproducerbara och robusta experiment. Vi fann också att de up-to-date metoder med dessa märkta GnRH-analoger kan erbjuda nya information om GnRH-baserade läkemedlet leveranssystem. Detta manuskript introducerar några enkla och snabba experiment rörande det cellulära upptaget av [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-II och [Lys 8 (FITC)] – GnRH -III på EBC-1 (lunga), den BxPC-3 (pankreas) och Detroit-562- (svalget) malignt tumor celler. Parallellt med dessa GnRH-FITC-konjugat, var cellytan nivån av GnRH-I-receptorer undersöktes också på dessa cellinjer före och efter GnRH-behandling genom konfokal laserscanningsmikroskopi. Det cellulära upptaget av GnRH-FITC-konjugat kvantifierades genom fluorescens-aktiverad cellsortering. I dessa experiment smärre skillnader mellan GnRH-analoger och stora skillnader mellan celltyper observerades. De betydande skillnaderna mellan cellinjer korrelerade med sin distinkta nivå på cellytan GnRH-I-receptorer. De införda experiment innehåller praktiska metoder för att visualisera, kvantifiera och jämföra upptagningen effektiviteten av GnRH-FITC-konjugat på ett tids- och koncentrationsberoende sätt på diverse vidhäftande cellkulturer. Dessa resultat kunde förutsäga det målsökande drog effektiviteten av GnRH-konjugat på den givna cellkulturen, och erbjuder en god grund för ytterligare experiment i granskningen av GnRH-baserade läkemedlet leveranssystem.
Introduction
Peptidbaserade Targeted Drug Delivery System har blivit en snabb utveckling och lovande område i cancerterapi under de senaste åren 1, 2. Humant gonadotropin releasing hormone receptor typ I (GnRH-IR) är i första hand ligger i hypofysen men också i flera andra vävnader som är ansvariga för självreproduktion 3. GnRH-IR uttrycks också i ett antal cancervävnader, relaterade eller orelaterade till det reproduktiva systemet 4, 5. Den höga uttryck av GnRH-IR på flera maligna tumörceller jämfört med friska vävnader ger en möjlighet för riktad terapi 5, 6.
Många gonadotropinfrisättande hormon (GnRH) analoger har utvecklats under de senaste decennierna, som skulle kunna användas som målsökande delarf "> 7, 8, 9. Dessa peptider kan leverera anticancermedel med hög selektivitet till maligna tumörceller, vilka överuttrycker GnRH-IR 6. Flera GnRH konjugerade anti-tumörläkemedel med högre selektivitet och bättre verkningsgrad än motsvarande okonjugerad fritt läkemedel har rapporterats 7, 8, 9.
Tidigare publikationer om GnRH-peptider och deras receptorer rapporterade att GnRH-IR kan anta olika konformationer som har olika selektivitet för GnRH-analoger 10. Den mycket varierande GnRH-IR har komplexa och olika signalvägar är utrustade med olika aktivitet mot deras naturliga och artificiella ligander 11. Dessa fakta gör undersökning av GnRH-baserade system utmanande. Å andra sidan, den y har lovande terapeutisk potential. Flera experiment med radiomärkt GnRH-peptider har tidigare redovisats 12, 13, 14, 15, men experiment där fluorescerande GnRH-analoger användes är fortfarande begränsad. Medan radioaktiv märkning ger hög känslighet, har fluorescerande märkning flera andra fördelar, till exempel enklare hantering, och förmågan att Motfärga med olika fluoroforer. Tre vanliga GnRH-analoger som framgångsrikt har använts för läkemedelstillförsel är [D-Lys 6] -GnRH-I, [D-Lys 6] -GnRH-II och GnRH-III, men effektiviteten av dessa peptider som målsökande delar är sällan jämfört 16, 17. Å andra sidan, resulterar från separata experiment i vilka olika cancerceller och GnRH-analoger användes är varierande.
ntent "> Baserat på dessa överväganden har vi fokuserat på tumören inriktning och drug delivery potentialen hos dessa GnRH-peptider, och därigenom syntetiseras och karakteriseras [D-Lys 6 (FITC)] – GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] – GnRH-II och [Lys 8 (FITC)] – GnRH-III peptidkonjugat 18 Dessa analoger är selektivt märkta med FITC på sidokedjan av deras Lys eller D-Lys (peptid-FITC-förhållande 1: 1 vid varje. konjugat). tanken var att den selektiva fluorescensmärkning kan erbjuda nya information om dessa peptider, och låter deras goda spårning och pålitlig kvantifiering. dessa konjugat har säker hantering och tillförlitlig detekterbarhet, som gör det lättare att jämföra deras tumörmåls effektivitet, och screening av många typer av maligna tumörceller. Vi hoppas att up-to date experiment med dessa peptidkonjugat kan bidra till utvecklingen av nya cancer inriktning GnRH-läkemedelskonjugat, och bidra till att identifiera ny terapeutisk tjärablir liksom.Den nuvarande manuskriptet visar några väl reproducerbara och snabba experiment med GnRH-FITC-konjugat. Cellytan uttryck av GnRH-R är ett avgörande villkor om GnRH-upptag, därför kan vi undersökas samtidigt cellytan nivån av GnRH-IR på de testade cellinjer. Vi visualiseras de GnRH-IR- och GnRH-FITC-konjugat från konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) och kvantifieras det cellulära upptaget av GnRH-FITC-konjugat med användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Experiment som beskrivs häri använder selektivt märkta GnRH-analoger för screening vidhäftande cellodlingar in vitro. Konfokal mikroskopi och flödescytometri metoder är lämpliga för att spåra och kvantifiera det cellulära upptaget av dessa GnRH-FITC-konjugat i en tid och koncentrationsberoende sätt. Dessa experiment har följande kritiska steg: 1) upprätthålla en steril, frisk cellkultur; 2) GnRH-peptider måste vara av hög kvalitet; 3) rimliga koncentrationer och inkubationstider mås…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The project was supported by National Research Fund OTKA (K 104045).
Materials
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0,1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | – | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
- Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11 (2016).
- Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
- Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues. Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).
- Schally, A. V., et al. Hypothalamic hormones and cancer. Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).
- Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
- Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
- Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
- Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
- Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
- Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -. L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
- Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
- Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
- Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
- Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
- Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists – A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
- Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
- Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
- Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).
