Summary
En metode til massespektrometrisk analyse af endogene peptider i menneskelige cerebrospinalvæske (CSF) er præsenteret. Ved hjælp af Molekylær vægt cut-off filtrering, kromatografisk pre fraktionering, massespektrometrisk analyse og en efterfølgende kombination af peptid identifikation strategier, var det muligt at udvide den kendte CSF peptidome næsten ti gange sammenlignet til tidligere undersøgelser.
Abstract
Denne protokol beskriver en metode udviklet til at identificere endogene peptider i menneskelige cerebrospinalvæske (CSF). Til dette formål, en tidligere udviklet metode baseret på Molekylær vægt cut-off (MWCO) filtrering og massespektrometriske analyse blev kombineret med en offline høj pH omvendt fase HPLC pre fraktionering trin.
Sekretion i CSF er den vigtigste vej for fjernelse af molekyler kaste af cellerne i centralnervesystemet. Således er mange processer i det centrale nervesystem afspejlet i CSF, gengivelse sig en værdifuld diagnostisk væske. CSF er en kompleks sammensætning, som indeholder proteiner, der spænder over et koncentrationsområde på 8-9 størrelsesordener. Udover proteiner, har tidligere undersøgelser også vist tilstedeværelsen af et stort antal af endogene peptider. Mens mindre grundigt undersøgt end proteiner, kan disse også afholde potentielle interesse som biomarkører.
Endogene peptider blev adskilt fra CSF proteinindhold gennem MWCO filtrering. Ved at fjerne et flertal af proteinindholdet fra prøven, er det muligt at øge den sample volumen studerede og dermed også det samlede beløb af de endogene peptider. Kompleksiteten af filtreres peptid blandingen blev behandlet ved at inkludere en omvendt fase (RP) HPLC pre fraktionering skridt på alkalisk pH forud for LC-MS analyse. Fraktionering blev kombineret med en simpel sammenkædning ordningen hvor 60 fraktioner var samlet til 12, kunne analyse tidsforbrug derved reduceres samtidig stadig i vid udstrækning undgå Co eluering.
Automatiseret peptid identifikation blev udført ved hjælp af tre forskellige peptid/protein identifikation softwareprogrammer og efterfølgende kombinerer resultaterne. De forskellige programmer var komplementære snarere end sammenlignelige med mindre end 15% af identifikationer overlappet mellem tre.
Introduction
Biomarkører i cerebrospinalvæske (CSF) i øjeblikket omdanne forskning til neurodegenerative lidelser. I Alzheimers sygdom, den mest almindelige neurodegenerativ sygdom, der påvirker over 60 millioner mennesker verden over1,2, en biomarkør triplet bestående af den amyloid beta peptid, mikrotubulus-stabiliserende protein tau, og en fosforyleret tau form, kan påvise sygdommen med høj følsomhed og specificitet, og er blevet inkluderet i den diagnostiske forskning kriterier3. I andre neurodegenerative sygdomme som Parkinsons sygdom og dissemineret sklerose, har proteom undersøgelser identificeret talrige biomarkør kandidater, hvoraf nogle er i øjeblikket under evaluering i kliniske studier4,5 ,6.
Sammen med proteiner indeholder CSF også et væld af endogene peptider7,8,9,10,11,12. Der udgør spaltningsprodukter af mange hjernen-afledte proteiner, repræsenterer disse peptider også et potentielt vigtig kilde til sygdommen biomarkører. For at øge lageret af identificerede endogene peptider i menneskelige CSF og aktiverer CSF endopeptidomic analyser i kliniske studier, blev udviklet en metode til forberedelse af prøver og LC-MS analyse (en kort protokolskemaet er blevet medtaget i figur 1 ). Anvendelsen af denne metode i en nylig undersøgelse resulterede i identifikation af næsten 16,400 endogene CSF peptider i poolede CSF prøver fra flere personer af ikke-specifik diagnose, udvide den kendte CSF endopeptidome billeddetaljerne13. Metoden kan eventuelt bruges i forbindelse med Isobar mærkning tilgang til kvantificering.
Forberedelse af prøver
Den vigtigste kilde til protein massen i CSF er plasma bestanddele (fx albumin og immunglobuliner) passerer over blod hjerne barrieren14,15. Deres høje overflod hæmmer påvisning af lav-rigelige, hjerne-afledte prøve komponenter. Endogene peptider kan adskilles let fra de høj-rigelige proteiner, hvorved en betydeligt større volumen af CSF peptid ekstrakt anvendes til LC-MS analyse, hvorved påvisning af lavere-rigelige peptider.
I protokollen præsenteres her, blev molekylvægt cut-off (MWCO) filtrering brugt til at adskille CSF peptider fra proteinfraktion; en metode, der er blevet brugt i flere tidligere undersøgelser8,9,10,11,12,16. Filtrering trin blev fulgt af en offline RP HPLC pre fraktionering trin udføres over en høj pH Mobil fase gradient. Ved at udføre to RP HPLC trin i tandem, med pH er den vigtigste forskel, forskellen i selektivitet mellem de to trin resultater hovedsagelig fra ændrede peptid opbevaring som følge af forskellige peptid afgift stater. Anvendelsen af høj pH peptid pre fraktionering forud for LC-MS under sure forhold har vist sig effektive i at øge peptid identifikation17,18, og selv at være overlegen i forhold til dette formål i komplekse biologiske prøver i forhold til flere ortogonale adskillelse tilstande19, såsom stærk kat-ion exchange (SCX) og RP20. For at forkorte tid, analyse, blev en sammenkædning ordningen benyttet, samle alle 12th brøkdel (fx, brøker 1, 13, 25, 37 og 49), som på grund af høj opløsningsevne af RP HPLC stadig i vid udstrækning undgået Co eluering af peptider fra forskellige fraktioner i LC-MS trin20,21.
Peptid identifikation
Peptid identifikation i peptidomic undersøgelser er forskellig fra proteom undersøgelser, ingen enzym spaltning kan være angivet i til databasesøgning, og som følge heraf identifikation priser er normalt lavere11. En nylig undersøgelse13 viste, at identifikation satser for endogene peptider fremstillet med Sequest og Mascot blev væsentligt forbedret, når standard scoring algoritme af respektive softwareprogram er blevet ændret ved hjælp af den adaptive scoring algoritme kaffemaskine, der angiver, at optimal scoring algoritmer for endogene peptider adskiller sig fra tryptic peptider13. I denne undersøgelse, identifikation baseret på automatiske peptid de novo sekventering bruger software toppe (BSI) blev anset for at være et supplement til to fragment ion fingeraftryk-baseret søgning motorerne, identificeret hvilket resulterer i en betydeligt større sæt af peptider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen beskrevet nedenfor er en raffineret version af den, der anvendes i en tidligere undersøgelse, hvor en stor mængde af endogene peptider blev identificeret i menneskelige CSF15. Opdateringer til den oprindelige protokol omfatter mindre ændringer i den kemiske forbehandling af CSF og optimering af den graduering, der benyttes til offline høj pH RP HPLC pre fraktionering.
Etiske overvejelser
Alle undersøgelser af svenske patienten og kontrol materialer er blevet godkendt af etiske komitéer: St. Göran (ref. 2005-554-31/3). CSF prøver fra Amsterdam demens kohorte og prøver, der opsamlet på National Hospital for neurologi og Neurokirurgi, London blev brugt til forskning med skriftligt samtykke fra alle deltagende patienter og godkendelse fra regionale etiske komitéer. Materialet her udnyttede hovedsagelig bestod af venstre-over CSF fra prøver til diagnose og det blev de identificerede før at blive medtaget i vores undersøgelser. Der er ikke mulighed for sporing tilbage prøven til enkelte donor eller gruppe af donorer.
1. udvinding af menneskelige cerebrospinalvæske (CSF):
- Uddrag CSF gennem lumbalpunktur (skal udføres af en uddannet læge) ved hjælp af en standardiseret protokol22.
- Fjerne celle debris og andre ikke-opløselige materiale ved centrifugering ved 2500 x g i 20 min.
- Inspicér visuelt CSF prøver for misfarvning, der kan indikere blod forurening som følge af punktering blødning. Betydeligt højere protein koncentrationen i blodet og tilstedeværelsen af proteaser kan stærkt påvirke analyseresultaterne.
2. forbehandling af CSF (1,5 mL prøve volumen, ingen kvantificering):
- Opd 1,5 mL af CSF alikvoter ved stuetemperatur (RT), overføre indholdet til 10 mL polypropylen rør og tilsættes 80 µL 1 M Triethylammonium bikarbonat (TEAB) som en bufferkapacitet agent.
- Tilføje 0,65 mL 8 M guanidinium hydrochlorid (GdnHCl) (aktiv koncentration GdnHCl: 2,4 M) og vortex forsigtigt på RT for 10 min.
Bemærk: Chaotropic agent, GdnHCl, både påvirker opløsningsmiddel viskositet og interagerer med polypeptid kæde, hvilket resulterer i protein udfolder sig at være energisk gunstige23. Således GdnHCl opløser protein aggregater og øger inddrivelsen af endogene peptider under efterfølgende filtrering. - Tilsættes 60 µL af 200 mM af vandige tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochlorid (TCEP) (aktiv koncentration TCEP: 6 mM) og inkuberes ved 55 ° C i 1 time at reducere cystein disulphides.
- Tilføje 35 µL af 400 mM iodoacetamide (IAA) (aktiv koncentration IAA: 4 mM) og inkuberes ved RT i mørket for 30 min til alkylatbenzin cysteines. Tilføjelse af en alkyl gruppen sikrer, at cystein restkoncentrationer ikke kan danne nye disulphide broer spontant på ethvert tidspunkt under efterfølgende prøveforberedelse.
- 3.25 mL afioniseret vand og vortex kort til fortyndes prøven før MWCO filtrering, hvilket resulterer i et samlet sample volumen på 5,5 mL tilsættes. Dette trin tjener til at fortynde GdnHCl til under 1 M som en højere koncentration er blevet observeret at undertiden forårsage udvaskning af polymere stoffer fra filter-enheder.
3. forbehandling af CSF (10 x 150 µL Sample volumen, Isobar mærkning-kvantificering):
- Tø 150 µL af CSF delprøver fra 10 personer på RT og derefter overføre indholdet til individuelle 1,5 mL lav-bindende mikro centrifugeglas og tilføje 8 µL 1 m TEAB som en bufferkapacitet agent.
- Tilføje 65 µL af 8 M GdnHCl (aktive koncentration GdnHCl: 2,4 M) og vortex forsigtigt på RT for 10 min.
- Tilføj 6 µL af 200 mM af vandige TCEP (aktive koncentration TCEP: 6 mM) og inkubation ved 55 ° C i 1 time at reducere cystein disulphides.
- Tilføje 3,5 µL 400 mM vandig IAA (aktive koncentration IAA: 6 mM) og inkuberes ved RT og mørke for 30 min til alkylatbenzin cysteines.
- Forberede den Isobar mærkning kit (fx., Tandem masse Tag 10plex Isobar mærkning reagens). Tillad Isobar mærkning reagens hætteglassene at nå RT før du åbner dem for at undgå unødvendige reagens hydrering, tilføje 41 µL HPLC-grade acetonitril (AcN) og opløses ved blid agitation i 5 min.
- Overføre 30 µL af Isobar mærkning reagens løsning til den tilsvarende prøve og Inkuber i 1 time på RT under blid agitation. Isobar mærkning reagenset omfatter en NHS-ester-gruppen, som reagerer med de primære aminer stede ved peptid N-termini og lysin restkoncentrationer.
- Tilføje 8 µL af 5% hydroxylamin (aktive koncentration hydroxylamin: 0,16%) og Ryst forsigtigt på RT for 20 min til at slukke den mærkning reaktion. Da separat mærket prøverne skal kombineres, sikre, at mærkningen bratkølet reaktion. Ved tilsætning af en overflod af amine grupper i form af hydroxylamin, de resterende Isobar mærkning reagens er tilladt at reagere og gengives således inert.
- Kombinere indholdet af hver af de 10 individuelt mærkede prøver i et enkelt 15 mL polypropylen rør.
- 6,4 mL afioniseret vand tilsættes til den kombinerede udsnit og vortex kort for at reducere AcN koncentration fra 12% til 3% og GdnHCl koncentration GdnHCl til under 1 M som en højere koncentration er blevet observeret at undertiden forårsage udvaskning af polymere stoffer fra filter-enheder.
4. molekylvægt cut-off filtrering
- For at fjerne potentielle forurenende stoffer, tilstand af MWCO filtre ved at indlæse 10 mL vandig 1 M GdnHCl, 25 mM TEAB og centrifugering i 15 min. på 2.500 x g og RT, kassere flow-gennem (FT).
- Indlæse hele prøven volumen på filteret (5 mL ikke-mærket CSF (trin 2,5) eller 10 mL isobarically mærket CSF (trin 3.9)) og centrifugeres for 30 min på 2.500 x g og RT, forlade gennemstrømning (FT) i objektbeholderen samling. Resultatet af filtrering er at peptider og små proteiner er adskilt fra større proteiner og resterende celle debris. Dette trin kan ses som peptidomic svarer til brugen af proteolytiske fordøjelsen af proteiner til at generere peptider i proteom eksperimenter.
- Indlæse 5 mL 25 mm TEAB (vandig) på filtre og centrifugeres i 15 min på 2.500 x g og RT, for at øge genopretningen af peptider.
- Vortex de kombinerede FTs fra de to foregående trin (en total 10 mL af ikke-mærket eller 15 mL isobarically mærket prøve), og gå videre til at prøve forsuring.
5. de-saltspredning og prøve oprydning af faste fase udvinding
- Surt den filtrerede prøve fra trin 4.4 forud for faste fase ekstraktion (SPE). Forsuringen er udført for at forbedre opløst stof (peptid) samspil med den stationære fase af SPE-patron.
- For de ikke-mærket prøve (bind 10 mL): tilføje 550 µL af 1% trifluoreddikesyre (TFA) - samlede volumen af prøven: 10.55 mL med 0,05% TFA.
- For eksemplet Isobar er mærket (bind 15 mL): der tilsættes 20 mL 0,1% TFA surt og sænke AcN koncentration fra 3% til 1% - samlede volumen af prøven: 30 mL med 0.066% TFA.
Bemærk: TFA føjes også til dens funktion som en ion-parring reagens, som forbedrer bevarelsen af peptider, ikke selv i stand til med tilstrækkelig stærk hydrofobe interaktion med emballagen af SPE patronen skal opbevares. - Hvis pH > 3, titreres prøven med 20% fosforsyre indtil prøven pH er < 3.
- Betingelse SPE patroner ved tilsætning af 1 mL af 84% AcN, 0,1% myresyre syre (FA) og kassér FT. Gentag én gang. Konditionering af filteret patron er forpligtet til at fjerne uønskede stoffer, som ellers ville elueres sammen med peptider i efterfølgende trin; yderligere, konditionering øger permeabilitet af filteret.
- Reagensglasset SPE patron ved tilsætning af 1 mL af 0,1% TFA, kassere FT. Repeat én gang. Sikre, at filteret ikke kører tør efter det sidste ækvilibrering trin - holde en lille volumen på toppen af filteret. Ækvilibrering patron filter er udført for at udarbejde et filter for at bevarer peptider ved at fjerne den hydrofobe stof (acetonitril) tilbage fra conditioning skridt.
- Indlæse hele sample volumen (10.55 mL for ikke-mærket prøver eller 30 mL isobarically mærket prøver), i flere portioner, hvis det er nødvendigt, og lad FT påkøre affald. Sikre at patronen ikke løbe tør mellem prøve lastning runder eller efter den sidste prøve volumen er blevet indlæst - holde en lille volumen på toppen af filteret.
- Passere 1 mL af 0,1% TFA over filtre til at fjerne salte og reagenser og kassér FT. Repeat én gang. Sikre, at patronen ikke kører tørt efter hver vask trin - holde en lille mængde væske på toppen af cylinderampullen.
- Sted 1,5 mL lave bindende mikro centrifugeres rør under patronen og elueres prøven ved at bestå 1 mL af 84% AcN, 0,1% FA over patronen.
- Fjern opløsningsmidler fra de-saltet prøven ved fordampning i et vakuum centrifuge køre uden aktiv varme indtil tør, opbevares ved-80 ° C eller gå straks til high-pH fraktionering.
6. offline høj pH omvendt fase HPLC prøve fraktionering
-
Forberede vandig high-pH (HpH) mobile faser:
HpH Buffer A: Rent vand
HpH Buffer B: 84% AcN
HpH Buffer C: 25 mM NH4OH
HpH Loading bufferen: 2,5 mM NH4OH, 2% AcN
Bemærk: HpH Loading bufferen er brugt som transport løsning og prøve buffer - Re opløse prøven i 16 µL HpH Loading bufferen ved blid agitation for 20 min
- Indlæse 15 µL prøve på en HPLC system med en indre brøkdel samler for 96-deep-godt plader konfigureret i henhold til Batth et al. 20 med mindre ændringer. Fractionate på en strøm af 100 µL/min over en pH-stabilt adskillelse kolonne (C18 3.5 µm, 2,1 mm x 250 mm) og indsamle en brøkdel pr. min. over en lineær 60 min gradient.
- Brug de følgende gradient tid-point: t = 0 min, B = 1%, C = 10%; t = 4 min, B = 1%, C = 10%, start brøkdel samling; t = 76 min, B = 70%, C = 10%; ende brøkdel samling; t = 76,5 min, B = 85%, C = 10%; t = 80 min., B = 85%, C = 10%; t = 80,5 min, B = 1%, C = 10% og t = 90 min, B = 1%, C = 10%.
- Indsamle fraktioner gentagne gange i 12 brønde i et cirkulært mønster, således sammenkæde fraktioner fordelt med 12 min, hvilket resulterer i 12 fraktioner, hver indeholder 6 sammenkædet sub fraktioner.
- Fjern opløsningsmidlet fra prøver af vakuum centrifugering ved RT og 3000 rpm indtil tør, og gemme prøver på-80 ° C før LC-MS analyse.
7. LC-MS
-
Forberede vandig mobile faser:
Buffer A: 0,1% FA
Buffer B: 0,1% FA, 84% AcN
Loading bufferen: 0,05% TFA, 2% AcN
Bemærk: Loading bufferen er brugt transportløsning, prøvebuffer og Mobil fase til lastning pumpe. - Re opløses hver af de 12 fraktioner ved tilsætning af 6 µL loading bufferen og ryster på RT for 20 min
- Belastning 5 µL prøve på en nano-flow HPLC, opererer i kolonne trapkonfiguration (trap kolonne: 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å porestørrelse, 3 µm partikelstørrelse; separation kolonne: C18, 75 µm x 500 mm, 100 Å porestørrelse, 2 µm partikelstørrelse , og udføre peptid adskillelse med en væskehastighed på 150 nL/min ved hjælp af de følgende forløb: t = 0 min, B = 2%; t = 10 min, B = 2%; t = 11 min, B = 7%; t = 100 min., B = 26%; t = 170 min., B = 45%; t = 175 min, B = 80%; t = 181 min, B = 2%, og t = 210 min, B = 2%.
-
Udføre MS på høj opløsning hybrid massespektrometer tilsluttet HPLC via en nano-ESI interface. Optag full scan-spektre i MS tilstand ved en opløsningsindstilling på 120.000 (2.0e5 AGC target) over rækken m/z 350-1.400.
- Betjene massespektrometer i data-afhængige erhvervelse mode, Vælg MS/MS-spektre fra de øverste ti mest intense toppe med m/z > 150 og inden for intensitet Interval 1.0e4-1.0e5 for fragment ion analyse. Isolere forløber ioner ved hjælp af en Quadrupol isolation vindue med 1 m/z, maksimal indsprøjtning 100 ms og RF linsen på 60%.
- Anvende dynamiske udstødelse med en udelukkelse tid 15 s og en m/z tolerance af ±10 ppm. Udføre opsplitning i cellen højere kollisionen energi dissociation (HCD) og optage MS/MS erhvervelser i orbitrap på en opløsningsindstilling på 50.000 (5.0e4 AGC målværdi).
8. peptid identifikation
-
For peptid identifikation indsende den resulterende .raw-filer fra den massespektrometriske analyse til en proteomics søgemaskine anvender følgende indstillinger:
Bemærk: I vores tidligere undersøgelse15, tre søgemaskiner; MASCOT v2.4, Sequest HT og toppe v7.5 benyttedes sideløbende og indstillingerne her angivet blev ansat for alle tre søgemaskiner, medmindre andet er angivet. Fleste af de justerbare indstillinger er universel for peptid/protein identifikation og skal have tilsvarende indstillinger i enhver given søgemaskine.
Spektrum vælgeren:
Min. forløber masse: 350 Da
Max. forløber masse: 5.000 Da
Skan type: fuld
Signal/støj tærskel: 1,5
Sekvens databasesøgning
Database: UniProt_SwissProt [version2015_11]
Taksonomi: Homo sapiens
Enzym: ingen
Max. savnet splittelser: 0
Instrument (kun maskot): ESI-fælde
Min. peptid længde (kun SequestHT): 6
Max. peptid længde (kun SequestHT): 144
Forløber masse tolerance: 15 ppm
Fragment masse tolerance: 0,05 Da
Statisk ændringer: Carbamidomethyl (C); [Hvis mærket] TMT10plex (N-sigt)
Dynamiske modifikationer: Oxidation (M); [Hvis mærket] TMT10plex (K)
Peptid-spektrum match (PSM) validator
Kaffemaskine (Mascot og Sequest HT kun) eller lokkedue Fusion (kun toppe)
Målrette FDR: 0,01
Validering baseret på: q-værdi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden beskrevet her har været anvendt og evalueret i tre undersøgelser forud for indførelsen af prøven før fraktionering (tabel 1). Den første undersøgelse bruges offline LC for at spotte CSF fraktioner på en MALDI target plade og resulterede i 730 identificerede endogene peptider11. I de to følgende undersøgelser, blev Isobar mærkning ansat. Primært i en case/control studie til identifikation og karakterisering af potentielle biomarkører i CSF endopeptidome og proteomet samtidig24, og i den anden undersøgelse Isobar mærkning blev brugt til at overvåge behandlingen virkninger in vivo af en γ-secretase hæmmer på peptid udtryk i CSF over 36 h16. I case/control studie identificeret 437 endogene peptider, 64, i betydelig grad ændret i koncentration mellem personer med AD og raske kontrolpersoner. Tredje, behandling studiet, identificeret 1798 endogene peptider, 11 af de overvågede peptider kunne påvises at reagere på behandlingen.
I den fjerde undersøgelse var formålet at øge antallet af identificerede CSF peptider, især til at identificere lavere-rigelige peptider. Derfor peptid pre fraktionering af HpH-RP kromatografi var inkluderet og en 10-fold større CSF sample volumen blev brugt, hvilket resulterer i identifikation af 16,395 peptider. I denne undersøgelse, blev ingen Isobar mærkning udført. Ud over at prøve fraktionering, den seneste undersøgelse ansat en kombineret peptid identifikation tilgang, der henviser til, at i de første tre undersøgelser blev kun en enkelt databasesøgning udført, som nogle omfang konti til det større antal peptider identificeret. Sammenligne resultaterne af de enkelte søgemaskiner (Mascot, Sequest HT eller toppe) fra den seneste undersøgelse viser, at de anvendte algoritmer er til en vis grad supplerer hinanden siden et relativt lille beløb, mindre end 15% (2440), af peptider er identificeret ved alle tre søgemaskiner (figur 2). Yderligere, de novo-sekventering search engine toppe var de mest effektive i at identificere endogene peptider, men mere end 5.400 peptider ikke ville er blevet identificeret, hvis der kun toppe havde været brugt (figur 2). Anvendelse af flere søgemaskiner på samme materiale har potentiale flere test spørgsmål og dette blev behandlet med en test af identifikation korrekthed13. Den erhvervede rå MS/MS data samt alle resultaterne i proteom søgninger fra den seneste retssag, som er gjort tilgængelige i arkivet stolthed data via ProteomeXchange med id PXD004863.
Figur 1: en protokolskemaet visualisere de vigtigste trin i metoden. Udvinding af cerebrospinalvæsken af lumbalpunktur efterfulgt af centrifugering at fjerne ikke-opløselige materiale, 2) tilsætning af GdnHCl til at prøve at adskille peptid-protein aggregater, øge inddrivelse af endogene peptider; reduktion og alkylering af cystein disulphides; Isobar mærkning for peptid kvantificering (valgfrit) 3) Molekylær vægt filtrering til at adskille de endogene peptider fra proteiner, 4) faste fase udvinding til at fjerne salte og andre polære stoffer, 5) RP HPLC pre fraktionering, basisk Mobil fase gradient og sammenkædning af hver 12th brøkdel, 6) RP HPLC-MS/MS, sure Mobil fase gradient, hver sammenkædede fraktion køre fortløbende, 7) peptid identifikation udføres ved at sende MS/MS data fra alle 12 analyse kører som en enkelt prøve til søgemaskiner, efterfølgende peptid-id'er blev sammenlignet og en Summering af alle unikke peptid id'er blev udført. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Undersøgelsesresumé | TMT mærkning (y/n) | HpH-RP fraktionering (y/n) | Tilsvarende volumen af CSF per MS-analyse (µl) | Antallet af identificerede peptider | Kommentar | Reference |
| Udforskende CSF peptidome analyse | n | n | 500 | 730 | Offline LC MALDI target forberedelse, MALDI-MS; evaluering af MWCO filtre | 4 |
| Kvantitativ sammenligning af CSF peptider; prøver fra 8 AD + 8 Ctrl | y | n | 200 | 437 | HPLC-ESI MS; kombinerede peptidomic og proteom protokol | 25 |
| Annonce gamma secretase hæmmer behandling undersøgelse | y | n | 300 | 1798 | HPLC-ESI MS; CSF udvundet på seks tidspunkter efter behandling | 17 |
| Udvide CSF peptidome | n | y | 750-1000 | 18.031 | HPLC-ESI MS; kombination af peptid id softwares | 15 |
Tabel 1: En samling af de seneste undersøgelser udført af denne gruppe, som gælder molekylvægt filtrering og massespektrometriske analyse til identifikation af endogene peptider i menneskelige CSF.
Figur 2: et Venn-diagram sammenligning peptid identifikation resultater opnået fra hver af de tre søgemaskiner Mascot, Sequest HT og TINDER. Ialt 16,395 endogene peptider blev identificeret. De novo-sekventering search engine toppe identificeret 10,967 endogene peptider; fragment-ion fingeraftryk-baseret søgning motorer maskot og Sequest HT identificeret 8118 og 7304 endogene peptider henholdsvis. Identifikation konsensus mellem alle tre søgemaskiner udgjorde 2440 endogene peptider eller 14,8%. Der var en relativt stor identifikation overlapning mellem maskot og Sequest HT, svarende til 70% af deres kombinerede peptid identifikationer. TOPPE havde en forholdsvis lille identifikation overlapper med både Mascot og Sequest HT; 20,5% og 18,9% henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indførelsen af et high-pH RP HPLC pre fraktionering skridt til en tidligere udviklet protokol for inddrivelse af endogene peptider ved molekylvægt ultrafiltrering11 reduceret relative prøve kompleksitet og mulighed dermed for en 5-fold større Sample volumen skal undersøges. Dette, til gengæld øget koncentration af delmængden af peptider til stede i hver fraktion og bedre dermed chancer for at afsløre lav rigelige peptider.
Ved at udføre en identifikation strategi for endogene peptider, som ansat tre proteom software sideløbende, var det muligt at udvide den kendte CSF endopeptidome mere end 10-fold. Ialt 16,395 endogene peptider blev identificeret i en indledende forsøg på en samlet CSF prøvemateriale. Blandt identifikationer var et stort antal af endogene peptider afledt af proteiner tidligere bemærket inden for neurodegenerative lidelser. Flere peptider identificeret i de ovenstående undersøgelser vurderes i øjeblikket som biomarkører i vores laboratorium. Denne proces indebærer flere skridt, herunder efterprøvning af peptider identiteter ved spiking CSF med syntetiske analoger mærket med tunge isotoper, etablering af målrettede massespektrometrisk assays, vurdering af peptid stabilitet under opbevaring og fryse-tø cykler og analysere forskellige kliniske kohorter.
Ændringer blev foretaget i den oprindelige protokol for at undgå indførelse af forurenende stoffer (trin 2,5 og 3,5) som følge af en høj koncentration af GdnHCl i prøven under MWCO-filtrering. En opdatering til pre fraktionering gradient (trin 6.3.1) blev lavet, kapacitet langvarig, lineær gradient bruges.
De primære årsager til analysanden tab i protokollen her beskrevet kan tilskrives de to RP kromatografiske trin samt MWCO filtrering og SPE prøve oprydning trin.
Peptid tab som følge af interaktion med MWCO-filter, eller proteiner bevaret på det, under filtrering er svært at undgå og kan være en kilde til inter prøve variation.
Yderligere opstå selektiv tab sandsynligvis i de RP-kromatografiske trin. Da peptid hydrophobicity er pH-afhængige, kan udføre to på hinanden følgende RP kromatografiske trin på højt og lavt pH, henholdsvis, føre til tab af delmængden af peptider, der er alt for hydrofile på pH ≥9 opbevares på den kolonne og ligeledes et andet delmængde for hydrofile på pH ≤3 skal bevares.
I forhold til tidligere anvendte metoder beskæftigelse af pre fraktionering har ført til en 10-fold stigning i identifikation af endogene peptider. Det er tilladt for vellykket påvisning af et stort antal af tidligere uidentificerede peptider og er derfor et værdifuldt værktøj i undersøgelse og udforskning af CSF peptidome, og eventuelt andre komplekse biologiske prøver så godt.
Kombineret med multipleksede Isobar mærkning protokollen er beregnet til at anvendes yderligere for at identificere biomarkør kandidater til forskellige neurodegenerative lidelser i CSF, blod og hjerne væv.
Varierende opsving i stikprøven forberedelsestrin bidrager til den analytiske variation til analyse af CSF proteiner og peptider ved LC-MS. udfører Isobar mærkning af peptider på et tidligt tidspunkt i stikprøven forberedelse falder indflydelse af sådanne variation stærkt. I forhold til tidligere rapporteret prøve forberedelse protokoller, steg gennemførelsen af høj pH med omvendt fase peptid pre fraktionering antallet af identificerede peptider med faktor 5. Identifikation af endogene peptider fra MS/MS-data blev betydeligt forbedret når kombinere forskellige peptid identifikation softwareprogrammer, ansætte forskellige søgealgoritmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen konkurrerende interesser, finansielle eller andre, mellem forfattere er blevet rapporteret.
Acknowledgments
Mange tak Tanveer Batth og kolleger til rådgivning i opsætning af metoden før fraktionering.
Dette arbejde blev støttet af midler fra det svenske Forskningsråd, Wallström og Sjöblom Foundation, pistolen og Bertil Stohne Foundation Stiftelse, Magnus Bergwall Foundation, Åhlén Foundation, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut og Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen og FoU-Västra Götalandsregionen.
De vigtigste modtagere af midlerne til dette projekt blev Kaj Blennow, Henrik Zetterberg og Johan Gobom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al.
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer's disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M.
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al.
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
