JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

Målretning cystein dithioler for in Vitro lokationsspecifikke glykosylering af rekombinante proteiner

Published: October 04, 2017
doi:
10.3791/56302
, , , , ,
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry,University of Western Ontario

Summary

Biokemiske og strukturelle analyser af glykosyleret proteiner kræver relativt store mængder af homogene prøver. Her præsenterer vi en effektiv kemisk metode for lokationsspecifikke glykosylering af rekombinante proteiner renset fra bakterier ved at målrette reaktive Cys dithioler.

Abstract

Stromale interaktion molekyle-1 (STIM1) er en type-jeg transmembrane protein beliggende på endoplasmatiske reticulum (ER) og plasma membraner (PM). ER hjemmehørende STIM1 regulerer aktiviteten af PM Orai1 kanaler i en proces kendt som lagre drives calcium (Ca2 +) post, som er den vigtigste Ca2 + signaling proces, der drev immunresponset. STIM1 gennemgår posttranslationelle N– glykosylering på to luminale Asn websteder inden for Ca2 + sensing domæne af molekylet. Men de biokemiske, Biofysisk, og struktur biologiske virkninger af N– glykosyleret STIM1 var dårligt forstået indtil for nylig på grund af manglende evne til at let opnå høje niveauer af homogene N– glykosyleret protein. Her, beskriver vi gennemførelsen af en in vitro- kemiske tilgang, som lægger glukose fraspaltning til specifikke protein websteder gælder for forståelsen af de underliggende effekter af N– glykosylering på protein struktur og mekanisme. Ved hjælp af løsning Kernemagnetisk resonans-spektroskopi vurdere vi både effektiviteten af ændringen og de strukturelle konsekvenser af glucose vedhæftet fil med en enkelt prøve. Denne tilgang kan let tilpasses for at studere de utallige glykosyleret proteiner findes i naturen.

Introduction

Gemme drives calcium (Ca2 +) post (SOCE) er den store vej som immunceller tage op Ca2 + fra det ekstracellulære rum i cytosol. I T-lymfocytter binder T-cellereceptorer placeret på plasma membran (PM) antigener, der aktiverer protein tyrosin kinaser (gennemgik i 1,2,3). En fosforylering kaskade fører til aktivering af fosfolipase-γ (PLCγ), som efterfølgende medierer hydrolyse af membran phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) til diacylglycerol og inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3 ). IP3 er en små diffusible messenger, som binder til IP3 receptorer (IP3R) på det endoplasmatiske reticulum (ER) dermed åbne denne receptor kanal og tillader Ca2 + til at flyde ned koncentration gradient fra Skadestuen lumen til cytosol (gennemgik i 4). Receptor signalering fra G-protein koblet og tyrosin kinase receptorer i en lang række andre overgearet og ikke-overgearet celle typer bly til den samme produktion af IP3 og aktivering af IP3Rs.

På grund af finite Ca2 + lagerkapacitet på Skadestuen, IP3-medieret frigivelse og deraf følgende stigning i cytosole Ca2 + er kun forbigående; men denne udtynding ER luminale Ca2 + dybt effekter stromale interaktion molekyle-1 (STIM1), en type-jeg transmembrane (TM) protein for det meste findes på ER membran 5,6,7. STIM1 indeholder en lumen-orienterede Ca2 + sensing domæne der består af en EF-hand par og sterile α-motiv (EFSAM). Tre cytosole-orienterede rullet coil domæner er adskilt fra EFSAM af domænet enkelt TM (gennemgik i 8). Efter ER luminale Ca2 + udtynding gennemgår EFSAM en destabilisering-kombineret oligomerisering 7,9 , som medfører strukturelle rearrangementer af TM og rullet coil domæner 10. Disse strukturelle ændringer kulminerer i en diffusering af STIM1 på ER-PM vejkryds 11,12,13,14 gennem interaktioner med PM phosphoinositides 15, 16 og Orai1 subunits 17,18. Orai1 proteiner er PM underenheder, som samles til form Ca2 + -kanaler 19,20,21,22. STIM1-Orai1 interaktioner i ER-PM vejkryds lette en åben Ca2 + release aktiveret Ca2 + (CRAC) kanal kropsbygning som muliggør bevægelse af Ca2 + i cytosol fra de høje koncentrationer af den ekstracellulære rum. I immunceller, de vedvarende cytosole Ca2 + højder via CRAC kanaler fremkalde den Ca2 +– calmodulin/calcineurin afhængige dephosphorylation af den nukleare faktor af aktiverede T-celler, der efterfølgende ind kernen og begynder transkriptionel regulering af gener fremme T-celle aktivering 1,3. Processen med CRAC kanal aktivering af STIM1 23,24 via agonist-induceret ER luminale Ca2 + udtynding og den deraf følgende vedvarende cytosole Ca2 + højde kaldes kollektivt SOCE 25. SOCE i T-celler afgørende rolle fremgår af undersøgelser viser, at arvelige mutationer i både STIM1 og Orai1 kan forårsage svær kombineret immundefekt syndromer 3,19,26, 27. EFSAM indleder SOCE efter sensing ER-luminale Ca2 + nedbrydning via tabet af Ca2 + koordinering på den kanoniske EF-side, i sidste ende fører til destabilisering-kombineret selvstændig forening 7, 28,29.

Glykosylering er kovalent udlæg og forarbejdning af oligosaccharid strukturer, også kendt som glycans, gennem forskellige biosyntetiske trin i ER og Golgi (gennemgik i 30,32,33). Der er to fremherskende typer af glykosylering i eukaryoter: N-sammenkædet og O-linket, afhængigt af den specifikke aminosyre og atom bridging koblingen. I N– glykosylering, glycans er knyttet til side kæde AMID af Asn, og i de fleste tilfælde opstår trinnet indledning på Skadestuen som polypeptid kæde flytter ind i lumen 34. Det første trin i N– glykosylering er overførsel af en fjorten-sukker core struktur bestående af glukose (Mona), mannose (mand) og N– acetylglukosamin (GlcNAc) (dvs. Ole3mand9GlcNAc2) fra en ER membran lipid af en oligosaccharyltransferase 35,36. Yderligere skridt, såsom kavalergang eller overførsel af glucose restkoncentrationer, er katalyseret på Skadestuen af specifikke glykosidaser og glycosyltransferases. Nogle proteiner, der forlader på Skadestuen og flytte ind i Golgi kan være yderligere forarbejdede 37. O– glykosylering refererer til tilsætning af glycans, normalt til side kæde hydroxylgruppe Ser eller Thr restkoncentrationer, og denne ændring forekommer udelukkende i Golgi kompleks 33,34. Der er flere O– glycan strukturer, som kan bestå af N– acetylglukosamin, fucose, galactose, og sialic syre med hver monosakkarid tilføjet sekventielt 33.

Mens ingen bestemt sekvens er blevet identificeret som forudsætning for mange typer af O– glykosylering, en fælles konsensus sekvens har været forbundet med N-forbundet ændring: Asn-X-Ser/Thr/Cys, hvor X kan være enhver aminosyre undtagen Pro 33. STIM1 EFSAM indeholder to af disse konsensus N– glykosylering sites: Asn131-Trp132-Thr133 og Asn171-Thr172-Thr173. Tidligere undersøgelser har vist, at EFSAM kan være N– glykosyleret i pattedyrceller ved Asn131 og Asn171 38,39,40,41. Men tidligere undersøgelser af konsekvenserne af N– glykosylering på SOCE har været inkongruente, foreslår undertrykt, forstærkede eller ingen effekt af denne posttranslationel modifikation på SOCE aktivering 38,= “xref” > 39,40,41. Forskning på de underliggende biofysiske, biokemiske og strukturelle konsekvenser af EFSAM N– glykosylering er således afgørende at begribe de regulerende virkninger af denne ændring. På grund af kravet om, at høje niveauer af ensartede proteiner i disse in vitro- eksperimenter, blev en site-selektiv tilgang til kovalent tillægger EFSAM glukose fraspaltning anvendt. Det er interessant, forårsaget Asn131 og Asn171 glykosylering strukturelle ændringer, der konvergerer inden for EFSAM kernen og forbedre de biofysiske egenskaber, som fremmer STIM1-medieret SOCE 42.

Glycosyl grupper kemiske tillægger Cys dithioler har været veletablerede af en skelsættende arbejde, som første gang demonstreret nytte af dette enzym-fri tilgang til forståelsen af de lokationsspecifikke effekter af glykosylering på protein funktion 43 , 44. for nylig og med hensyn til STIM1, Asn131 og Asn171 rester var muteret til Cys og glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] blev brugt kovalent linke glukose til gratis dithioler 42. Her, beskriver vi denne tilgang, som ikke kun bruger mutagenese for at indarbejde site specifikke Cys restkoncentrationer for ændring, men gælder også løsning Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi til at hurtigt at vurdere både ændring effektivitet og struktur forstyrrelser som følge af glykosylering. Især denne generelle metode er let at tilpasse til at studere virkningerne af enten O– eller N– glykosylering af nogen recombinantly produceret protein.

Protocol

1. Polymerasekædereaktionen (PCR)-medieret site-directed mutagenese til indbygning af Cys i en bakteriel pET-28a udtryk vektor. Bestemmes koncentrationen af pET-28a vektor (dvs. dobbelt strandede DNA) ved hjælp af en ultraviolet (UV) udryddelse koefficient af 0,020 (μg/mL) cm -1 på 260 nm. Syntetisere et par supplerende mutagene primere for hver Cys mutation sådan at jeg) der er et minimum af 15 nukleotider supplement til skabelonen før første base uoverensstemmelse og 15 n…

Representative Results

Det første trin i denne fremgangsmåde kræver mutagenese af kandidat glykosylering restkoncentrationer Cys restprodukter, som kan ændres ved hjælp af glukose-5-MTS. EFSAM har ingen endogene Cys rester, så ingen særlige overvejelser skal foretages forud for den mutagenese. Dog skal indfødte Cys restkoncentrationer være muteret til ikke-modificerbare rester inden du udfører de beskrevne kemi. For at minimalt påvirke den oprindelige struktur, foreslår vi, at udføre en global sekv…

Discussion

Protein glykosylering er en posttranslationel modifikation hvor sukker er kovalent knyttet til polypeptider primært gennem forbindelser til aminosyre sidekæder. Så mange som 50% af pattedyr proteiner er glykosyleret 54, hvor glykosyleret proteiner kan efterfølgende har en bred vifte af effekter fra at ændre Biomolekylær bindende affinitet, påvirke protein foldning, ændre kanal aktivitet, målretning molekyler nedbrydning og cellulære handel, for at nævne et par stykker (gennemgik i<sup c…

Acknowledgements

Denne forskning blev støttet af naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada (05239 til PBS), canadiske Foundation for Innovation/Ontario forskningsfond (til PBS), Prostata Cancer kæmpe Foundation – Telus Ride for far (til PBS) og Ontario Graduate stipendium (til Y.J.C. og N.S.).

Materials

Phusion DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530S Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific FERSM1163 Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme New England Biolabs, Inc. R0176 Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit GeneAid, Inc. PDH300 Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli Agilent Technologies, Inc. 230280 Use in step 2.1.
DH5a E. coli Invitrogen, Inc. 18265017 Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter Millipore, Inc. SLGV033RS Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin Thermo Fisher Scientific 88221 Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing BioDesign, Inc. D306 Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin BioPharm Laboratories, Inc. SKU91-055 Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5156-01 Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS Toronto Research Chemicals, Inc. G441000 Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators Sartorius, Inc. VS2001 Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26630 Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5053-01 Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System GE Healthcare, Inc. 29018224 Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer Agilent Technologies, Inc. Use in step 5.2 and 5.5.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).
  2. Feske, S., Skolnik, E. Y., Prakriya, M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 12 (7), 532-547 (2012).
  3. Shaw, P. J., Feske, S. Physiological and pathophysiological functions of SOCE in the immune system. Front Biosci (Elite Ed). 4, 2253-2268 (2012).
  4. Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
  5. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural aspects of calcium-release activated calcium channel function. Channels (Austin). 7 (5), 344-353 (2013).
  6. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structure and function of endoplasmic reticulum STIM calcium sensors. Curr Top Membr. 71, 59-93 (2013).
  7. Stathopulos, P. B., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ames, J. B., Ikura, M. Stored Ca2+ depletion-induced oligomerization of stromal interaction molecule 1 (STIM1) via the EF-SAM region: An initiation mechanism for capacitive Ca2+ entry. J Biol Chem. 281 (47), 35855-35862 (2006).
  8. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Store operated calcium entry: From concept to structural mechanisms. Cell Calcium. , (2016).
  9. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structurally delineating stromal interaction molecules as the endoplasmic reticulum calcium sensors and regulators of calcium release-activated calcium entry. Immunol Rev. 231 (1), 113-131 (2009).
  10. Muik, M., et al. STIM1 couples to ORAI1 via an intramolecular transition into an extended conformation. EMBO J. 30 (9), 1678-1689 (2011).
  11. Luik, R. M., Wang, B., Prakriya, M., Wu, M. M., Lewis, R. S. Oligomerization of STIM1 couples ER calcium depletion to CRAC channel activation. Nature. 454 (7203), 538-542 (2008).
  12. Luik, R. M., Wu, M. M., Buchanan, J., Lewis, R. S. The elementary unit of store-operated Ca2+ entry: local activation of CRAC channels by STIM1 at ER-plasma membrane junctions. J Cell Biol. 174 (6), 815-825 (2006).
  13. Wu, M. M., Buchanan, J., Luik, R. M., Lewis, R. S. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol. 174 (6), 803-813 (2006).
  14. Liou, J., Fivaz, M., Inoue, T., Meyer, T. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+ store depletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9301-9306 (2007).
  15. Calloway, N., et al. Stimulated association of STIM1 and Orai1 is regulated by the balance of PtdIns(4,5)P(2) between distinct membrane pools. J Cell Sci. 124 (Pt 15), 2602-2610 (2011).
  16. Korzeniowski, M. K., et al. Dependence of STIM1/Orai1-mediated calcium entry on plasma membrane phosphoinositides. J Biol Chem. 284 (31), 21027-21035 (2009).
  17. Park, C. Y., et al. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. Cell. 136 (5), 876-890 (2009).
  18. Yuan, J. P., et al. SOAR and the polybasic STIM1 domains gate and regulate Orai channels. Nat Cell Biol. 11 (3), 337-343 (2009).
  19. Feske, S., et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature. 441 (7090), 179-185 (2006).
  20. Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
  21. Vig, M., et al. CRACM1 multimers form the ion-selective pore of the CRAC channel. Curr Biol. 16 (20), 2073-2079 (2006).
  22. Vig, M., et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Science. 312 (5777), 1220-1223 (2006).
  23. Liou, J., et al. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Curr Biol. 15 (13), 1235-1241 (2005).
  24. Roos, J., et al. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol. 169 (3), 435-445 (2005).
  25. Putney, J. W. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium. 7 (1), 1-12 (1986).
  26. Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. 460 (2), 417-435 (2010).
  27. Maus, M., et al. Missense mutation in immunodeficient patients shows the multifunctional roles of coiled-coil domain 3 (CC3) in STIM1 activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6206-6211 (2015).
  28. Stathopulos, P. B., Zheng, L., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ikura, M. Structural and mechanistic insights into STIM1-mediated initiation of store-operated calcium entry. Cell. 135 (1), 110-122 (2008).
  29. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Partial unfolding and oligomerization of stromal interaction molecules as an initiation mechanism of store operated calcium entry. Biochem Cell Biol. 88 (2), 175-183 (2010).
  30. Dennis, J. W., Lau, K. S., Demetriou, M., Nabi, I. R. Adaptive regulation at the cell surface by N-glycosylation. Traffic. 10 (11), 1569-1578 (2009).
  31. Nilsson, T., Au, C. E., Bergeron, J. J. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi apparatus. FEBS Lett. 583 (23), 3764-3769 (2009).
  32. Stanley, P. Golgi glycosylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (4), (2011).
  33. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  34. Gerlach, J., Sharma, S., Leister, K., Joshi, L., Agostinis, P., Afshin, S. . Endoplasmic Reticulum Stress in Health and Disease. , 23-39 (2012).
  35. Pearse, B. R., Hebert, D. N. Lectin chaperones help direct the maturation of glycoproteins in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 684-693 (2010).
  36. Stanley, P., Sundaram, S. Rapid assays for lectin toxicity and binding changes that reflect altered glycosylation in mammalian cells. Curr Protoc Chem Biol. 6 (2), 117-133 (2014).
  37. Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
  38. Csutora, P., et al. Novel role for STIM1 as a trigger for calcium influx factor production. J Biol Chem. 283 (21), 14524-14531 (2008).
  39. Kilch, T., et al. Mutations of the Ca2+-sensing stromal interaction molecule STIM1 regulate Ca2+ influx by altered oligomerization of STIM1 and by destabilization of the Ca2+ channel Orai1. J Biol Chem. 288 (3), 1653-1664 (2013).
  40. Williams, R. T., et al. Stromal interaction molecule 1 (STIM1), a transmembrane protein with growth suppressor activity, contains an extracellular SAM domain modified by N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta. 1596 (1), 131-137 (2002).
  41. Mignen, O., Thompson, J. L., Shuttleworth, T. J. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. 579 (Pt 3), 703-715 (2007).
  42. Choi, Y. J., Zhao, Y., Bhattacharya, M., Stathopulos, P. B. Structural perturbations induced by Asn131 and Asn171 glycosylation converge within the EFSAM core and enhance stromal interaction molecule-1 mediated store operated calcium entry. Biochim Biophys Acta. 1864 (6), 1054-1063 (2017).
  43. Davis, B. G., Lloyd, R. C., Jones, J. B. Controlled site-selective protein glycosylation for precise glycan structure-catalytic activity relationships. Bioorg Med Chem. 8 (7), 1527-1535 (2000).
  44. Gamblin, D. P., van Kasteren, S. I., Chalker, J. M., Davis, B. G. Chemical approaches to mapping the function of post-translational modifications. FEBS J. 275 (9), 1949-1959 (2008).
  45. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Methods Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  46. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Bell, D. J. Mass spectrometry. Methods Mol Biol. 244, 447-454 (2004).
  49. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  50. Farrow, N. A., et al. Backbone Dynamics of a Free and a Phosphopeptide-Complexed Src Homology-2 Domain Studied by N-15 Nmr Relaxation. Biochemistry. 33 (19), 5984-6003 (1994).
  51. Kay, L. E., Keifer, P., Saarinen, T. Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity. Journal of the American Chemical Society. 114 (26), 10663-10665 (1992).
  52. Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  53. Masse, J. E., Keller, R. AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic. J Magn Reson. 174 (1), 133-151 (2005).
  54. Monticelli, M., Ferro, T., Jaeken, J., Dos Reis Ferreira, V., Videira, P. A. Immunological aspects of congenital disorders of glycosylation (CDG): a review. J Inherit Metab Dis. 39 (6), 765-780 (2016).
  55. An, H. J., Kronewitter, S. R., de Leoz, M. L., Lebrilla, C. B. Glycomics and disease markers. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 601-607 (2009).
  56. Wani, W. Y., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V., McMahon, L. L., Zhang, J. O-GlcNAcylation and neurodegeneration. Brain Res Bull. , (2016).
  57. Haines, A. M., Tobe, S. S., Kobus, H. J., Linacre, A. Properties of nucleic acid staining dyes used in gel electrophoresis. Electrophoresis. 36 (6), 941-944 (2015).

Tags

Cysteine ThiolsSite-specific GlycosylationRecombinant ProteinsStructural BiologyGlycosylation PatternsDisease TherapyPCR MutagenesisDPN1 DigestionProtein Expression
check_url/56302?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S., Siddiqui, N., Feng, Q., Stathopulos, P. B. Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. (128), e56302, doi:10.3791/56302 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image