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Immunology and Infection

Targeting Cystein Thiole für in-vitro- standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen

Published: October 04, 2017
doi:
10.3791/56302
, , , , ,
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry,University of Western Ontario

Summary

Biochemische und strukturelle Analysen des glykosylierten Proteinen erfordern relativ große Mengen an homogenen Proben. Hier präsentieren wir Ihnen eine effiziente chemische Methode für standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen durch gezielte reaktive Cys Thiole von Bakterien gereinigt.

Abstract

Stromale Interaktion Molekül-1 (STIM1) ist eine Art-ich transmembranen Protein im endoplasmatischen Retikulum (ER) und die Plasmamembranen (PM) gelegen. ER-Resident STIM1 reguliert die Aktivität der PM Orai1 Kanäle in einem Prozeß bekannt als betriebenen Kalzium (Ca2 +) Eintrag zu speichern, die die wichtigsten Ca2 + Signalisierung erfolgt, die die Immunantwort antreibt. STIM1 erfährt post-translationalen N– Glykosylierung an zwei luminalen Asn-Standorten innerhalb der Ca2 + Fernerkundung Domäne des Moleküls. Aber die biochemische, biophysikalische, und Struktur biologischen Wirkungen von N– glykosylierten STIM1 waren schlecht verstanden, bis vor kurzem aufgrund einer Unfähigkeit, ohne weiteres hohes Maß an homogenen N– glykosyliertes Protein zu erhalten. Hier beschreiben wir die Umsetzung eines in-vitro- chemische Ansatzes, das Glukose Moieties spezifisches Protein Websites anwendbar zum Verständnis der zugrunde liegenden Auswirkungen der N– Glykosylierung auf Protein-Struktur und Mechanismus beimisst. Mit magnetischen Kernresonanz-Spektroskopie Lösung bewerten wir sowohl Effizienz der Änderung sowie die strukturellen Konsequenzen der Glukose-Anlage mit einer einzigen Probe. Dieser Ansatz kann leicht angepasst werden, um die unzähligen glycosylierten Proteine in der Natur zu studieren.

Introduction

Speichern betriebenen Kalzium (Ca2 +) Eintrag (SOCE) ist der große Weg durch die Immunzellen Ca2 + aus dem extrazellulären Raum in das Zytosol nehmen. In T-Lymphozyten binden T-Zell-Rezeptoren auf der Plasmamembran (PM) Antigene die Protein-Tyrosin-Kinasen (rezensiert in 1,2,3) aktivieren. Eine Phosphorylierung Kaskade führt zur Aktivierung der Phospholipase-γ (PLCγ), die anschließend die Hydrolyse von Membran Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate (PIP2) in Diacylglycerol und Inositol-1,4,5-Trisphosphate (IP-3 vermittelt ). IP-3 ist ein kleines diffusiblem Bote die IP3 an Rezeptoren (IP-3R) auf dem endoplasmatischen Retikulum (ER bindet) damit dieser Rezeptor-Kanal öffnen und schönem Ca2 + nach unten das Konzentrationsgefälle aus der Notaufnahme fortgesetzt Lumen zu dem Zytosol (rezensiert in 4). Rezeptor Signalisierung von G-Protein gekoppelt und Tyrosin-Kinase-Rezeptoren in einer Vielzahl von anderen erregbaren und nicht erregbaren Zelle Arten führen die gleiche Produktion von IP-3 und Aktivierung von IP3Rs.

Aufgrund der endlichen Ca2 + Speicherkapazität von der Notaufnahme, die IP-3-vermittelte Freisetzung und daraus resultierende Erhöhung der cytosolischen Ca2 + ist nur vorübergehend; diese Erschöpfung des ER luminalen Ca2 + Effekte jedoch zutiefst Stromazellen Interaktion Molekül-1 (STIM1), eine Art-ich transmembranen (TM) Protein meist zu finden, auf die ER Membran 5,6,7. STIM1 enthält eine Lumen-orientierte Ca2 + Fernerkundung Domäne bestehend aus ein paar EF-Hand und sterile α-Motiv (EFSAM). Drei cytosolische orientierten coiled-Coil-Domänen sind von EFSAM durch die TM-Einzeldomäne (rezensiert in 8) getrennt. Auf ER luminalen Ca2 + Erschöpfung erfährt EFSAM eine Destabilisierung gekoppelt Oligomerisierung 7,9 wodurch strukturelle Umstellungen der TM und coiled-Coil-Domänen 10. Diese strukturellen Veränderungen münden in ein Überfüllen des STIM1 bei ER-PM Kreuzungen 11,12,13,14 durch Interaktionen mit PM Phosphoinositides 15, 16 und Orai1 Untereinheiten 17,18. Orai1 Proteine sind die PM-Untereinheiten die Form Ca2 + Kanäle 19,20,21,22montieren. Die STIM1-Orai1-Interaktionen an ER-PM Kreuzungen erleichtern eine offene Ca2 + Freigabe aktiviert Ca2 + (CRAC) Kanal Konformation ermöglicht die Bewegung von Ca2 + in der Zellflüssigkeit aus den hohen Konzentrationen von der Extrazellulärraum. In Immunzellen, die nachhaltige cytosolischen Ca2 + Höhen CRAC Dienstweg induzieren die Ca2 +– Calmodulin/Calcineurin abhängigen Dephosphorylation des nuklearen Faktors der aktivierten T-Zellen die Folge den Kern tritt und transkriptionelle Regulierung der Gene, die Förderung der T-Zell-Aktivierung 1,3beginnt. Der Prozess der CRAC Kanal Aktivierung durch STIM1 23,24 über Agonist-induzierte ER luminalen Ca2 + Erschöpfung und die daraus resultierende nachhaltige cytosolischen Ca2 + Höhe wird Kollektiv SOCE 25bezeichnet. Die entscheidende Rolle der SOCE in T-Zellen ist offensichtlich durch Studien, die zeigen, dass vererbbare Mutationen in STIM1 und Orai1 dazu führen, Severe Combined Immunodeficiency Syndrome 3,19,26, dass können 27. EFSAM initiiert SOCE nach sensing ER luminalen Ca2 + Erschöpfung über den Verlust von Ca2 + Koordinierung auf die kanonische EF-Hand, letztlich zu der Destabilisierung gekoppelt Selbstassoziation 7, 28,29.

Glykosylierung ist die kovalente Bindung und Verarbeitung von Oligosaccharid Strukturen, auch bekannt als Glykane, durch verschiedene biosynthetischen Schritte in der ER und Golgi (rezensiert in 30,32,33). Es gibt zwei vorherrschende Arten der Glykosylierung in Eukaryoten: N-verknüpften und O-verbunden, abhängig von der spezifischen Aminosäure und Atom überbrücken die Verknüpfung. In N– Glykosylierung Glykane Seite Kette Amid von Asn befestigt sind und in den meisten Fällen die Einleitung Schritt erfolgt in der Notaufnahme als das Polypeptid Kette bewegt sich in das Lumen- 34. Der erste Schritt der N– Glykosylierung ist die Übertragung einer vierzehn-Zucker Kern-Struktur, bestehend aus Glukose (Glc), Mannose (Mann) und N– Acetylglucosamin (GlcNAc) (d. h. Glc3Man9GlcNAc-2) aus einem ER Membran-Lipid durch eine Oligosaccharyltransferase 35,36. Weitere Schritte, wie Dekolleté oder Übertragung von Glukose Rückstände sind in der Notaufnahme von spezifischen Glycosidases und Glycosyltransferases katalysiert. Einige Proteine, die ER verlassen und bewegen in die Golgi können weiter verarbeiteten 37sein. O– Glykosylierung bezieht sich auf die Zugabe von Glykoproteinen, in der Regel auf der Seite Kette Hydroxylgruppe des Ser oder Thr Rückstände, und diese Änderung tritt ganz in die Golgi-Komplex 33,34. Gibt es mehrere O– Glykan-Strukturen, die von N– Acetylglucosamin, Fucose, Galaktose gebildet werden können, und Sialinsäure Säure mit jeder Monosaccharid hinzugefügt sequenziell 33.

Während keine bestimmte Reihenfolge als Voraussetzung für viele Arten von O– Glykosylierung identifiziert wurde eine gemeinsame Konsensussequenz Nzugeordnet wurde-Änderung verbunden: Asn-X-Ser/Thr/Cys, wo X kann jede Aminosäure sein mit Ausnahme von Pro- 33. STIM1 EFSAM enthält zwei dieser Konsens N– Glykosylierung Seiten: Asn131-Trp132-Thr133 und Asn171-Thr172-Thr173. In der Tat haben frühere Studien gezeigt, dass EFSAM N– glykosylierten in Säugerzellen bei Asn131 und Asn171 38,39,40,41sein kann. Jedoch frühere Studien der Folgen der N– Glykosylierung auf SOCE inkongruent gewesen, unterdrückt was darauf hindeutet, potenzierte oder keinen Einfluss durch diese Post-translationale Modifikation am SOCE Aktivierung 38,= “Xref” > 39,40,41. Forschung über die zugrunde liegenden biophysikalischen, biochemischen und strukturelle Folgen der EFSAM N– Glykosylierung unbedingt so verstehen die rechtlichen Auswirkungen dieser Änderung. Aufgrund der Voraussetzung für hohe homogene Proteine in diesen in-vitro- Experimenten wurde eine Website selektiv kovalent Glukose Moieties EFSAM beimessen angewendet. Interessant ist, verursacht Asn131 und Asn171 Glycosylation Strukturveränderungen, die innerhalb des EFSAM Kerns konvergieren und verbessern die biophysikalischen Eigenschaften, die STIM1-vermittelten SOCE 42zu fördern.

Die chemische Befestigung der a1 Gruppen mit Cys Thiole hat durch eine Samen-Arbeit etabliert, die die Nützlichkeit dieser enzymfreien Ansatz zum Verständnis der standortspezifischen Auswirkungen der Glykosylierung auf Protein-Funktion 43 erstmals nachgewiesen , 44. jüngerer Zeit und in Bezug auf STIM1, die Asn131 und Asn171 Rückstände waren, Cys mutiert und glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] wurde verwendet, um Glukose kovalent mit kostenlosen Thiole 42zu verknüpfen. Hier beschreiben wir dieses Konzept bei dem nicht nur Mutagenese benutzt Website bestimmte Cys Rückstände für Änderung zu integrieren, sondern gilt auch Lösung Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie schnell Änderung Effizienz und strukturelle bewerten Störungen durch die Glykosylierung. Insbesondere diese allgemeine Methodik ist leicht anpassbar Studie zu den Auswirkungen der beiden O– oder N– Glykosylierung eines rekombinant Protein produziert.

Protocol

1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-vermittelte Site-verwiesene Mutagenese für die Einbeziehung der Cys in eine bakterielle Haustier-28a Expressionsvektor. Bestimmen die Konzentration des pET-28a Vektors (d.h. doppelte stranded DNA) mit einem ultravioletten (UV) Aussterben Koeffizienten von 0.020 (μg/mL) cm -1 bei 260 nm. Synthetisieren ein paar ergänzende mutagene Zündkapseln für jede Cys Mutation die ich) gibt es ein Minimum von 15 Nukleotide komplementär zu der Vorlage, be…

Representative Results

Der erste Schritt dieses Ansatzes erfordert die Mutagenese der Kandidat Glykosylierung Rückstände Cys Rückstände die modifizierbar mit Glukose-5-m EFSAM sein können hat keine endogenen Cys-Rückstände, also keine besonderen Überlegungen vor dem vorgenommen werden müssen die Mutagenese. Allerdings müssen native Cys Rückstände nicht veränderbaren Rückstände vor der Durchführung der beschriebenen Chemie mutiert werden. Um die native Struktur minimal zu bewirken, empfiehlt sich…

Discussion

Protein Glycosylation ist eine Post-translationale Modifikation wo Zucker kovalent an Polypeptide in erster Linie durch Verbindungen zu den Aminosäure-Seitenketten befestigt sind. Mehr als 50 % der Säugetiere Proteine sind glykosylierten 54, wo der glycosylierten Proteine anschließend haben können vielfältige Effekte von biomolekularen Bindungsaffinität zu verändern, Protein Falten, Channel-Aktivität verändern, gezielt zu beeinflussen Moleküle für Abbau und zellulären Menschenhandel, t…

Acknowledgements

Diese Forschung wurde unterstützt durch die Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (05239, B.P.S), kanadische Stiftung für Innovation/Ontario Research Fund (zu B.P.S), Prostata Krebs kämpfen Foundation – Telus Ride für Papa (zu B.P.S) und Ontario Graduate Stipendium (für Y.J.C. und N.S.).

Materials

Phusion DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530S Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific FERSM1163 Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme New England Biolabs, Inc. R0176 Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit GeneAid, Inc. PDH300 Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli Agilent Technologies, Inc. 230280 Use in step 2.1.
DH5a E. coli Invitrogen, Inc. 18265017 Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter Millipore, Inc. SLGV033RS Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin Thermo Fisher Scientific 88221 Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing BioDesign, Inc. D306 Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin BioPharm Laboratories, Inc. SKU91-055 Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5156-01 Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS Toronto Research Chemicals, Inc. G441000 Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators Sartorius, Inc. VS2001 Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26630 Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5053-01 Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System GE Healthcare, Inc. 29018224 Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer Agilent Technologies, Inc. Use in step 5.2 and 5.5.
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Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S., Siddiqui, N., Feng, Q., Stathopulos, P. B. Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. (128), e56302, doi:10.3791/56302 (2017).
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