Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme
Summary
Biyokimyasal ve yapısal analizleri glikozile proteinlerin homojen örnekleri nispeten büyük miktarda gerektirir. Burada, reaktif Cys thiols hedefleyerek bakterilerden saflaştırılmış rekombinant proteinlerin siteye özgü Glikozilasyon için verimli bir kimyasal yöntem mevcut.
Abstract
Stromal etkileşim molekülü-1 (STIM1) bir türüdür-ben transmembran protein bulunan endoplazmik retikulum (ER) ve plazma membran (AM). ER-resident STIM1 am Orai1 kanalları bağışıklık yanıtı sürücüler asıl Ca2 + sinyal gönderme işlemi olan işletilen kalsiyum (Ca2 +) girişi saklamak olarak bilinen bir süreç içinde etkinlik düzenlemektedir. STIM1 Ca2 + algılama etki molekülün içinde iki luminal Asn sitelerdeki post-translational N– glikozilasyon uğrar. Ancak, biyokimya, biyofizik, ve N– glikozile STIM1 yapısı biyolojik etkileri kötü kolaylıkla homojen N– glikozile protein yüksek seviyede elde etmek için son zamanlarda bir yetersizlik nedeniyle kadar anladım. Burada, hangi temel N– glikozilasyon protein yapısı ve etkileri mekanizmasını anlamak için ilgili belirli protein sitelere glikoz moieties verdiği bir vitro kimyasal yaklaşım uygulanması açıklanmaktadır. Çözüm Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi kullanılarak değişiklik her iki verimliliğini yanı sıra tek bir örnek glikoz ekli yapısal sonuçlarını değerlendirmek. Bu yaklaşım kolayca doğada bulunan sayısız glikozile proteinler çalışmaya adapte edilebilir.
Introduction
İşletilen kalsiyum (Ca2 +) depolamak girişidir (SOCE) hangi tarafından bağışıklık hücreleri almak Ca2 + sitozol ekstraselüler uzaya üzerinden büyük yol. T lenfositler, plazma zarı (PM) yer alan T hücre reseptör protein tirozin kinaz ( 1,2,3‘ te gözden) etkinleştirmek antijenleri bağlayın. Bir fosforilasyon çağlayan fosfolifaz-γ (PLCγ) hangi daha sonra diacylglycerol ve inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3 membran phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) hidroliz aracılık eder aktivasyonu yol açar ). IP3 konsantrasyon degrade acil servis üzerinden aşağı akmaya böylece bu reseptör kanal açma ve Ca2 + izin IP3 için (IP3R) üzerinde reseptörleri endoplazmik retikulum (ER) bağlayan bir küçük diffusible elçisidir Lümen ( 4‘ te gözden) sitozol için. Reseptör birleştiğinde gr protein ve tirozin kinaz reseptörleri başka bir heyecanlı ve telaşlı hücre türleri sorumlu çeşitli IP3 aynı üretim ve IP3Rs aktivasyonu için sinyal.
Sonlu Ca2 + depolama kapasitesini ER, IP3nedeniyle-aracılı yayın ve sonuç artış sitozolik Ca2 + sadece geçici; Bununla birlikte, bu tükenmesi ER luminal Ca2 + derinden stromal etkileşim molekülü-1 (STIM1), bir tür etkiler-ben transmembran (TM) protein çoğunlukla üzerinde ER membran 5,6,7bulundu. STIM1 bir EF-el çift ve steril α-motifi (EFSAM) oluşan bir Lümen odaklı Ca2 + algılama etki alanı içerir. Üç sitozolik odaklı dolandı-coil etki alanı EFSAM ( 8‘ gözden) tek TM etki alanı tarafından ayrılır. ER luminal Ca2 + tükenmesi, yapısal düzenlemeler TM ve kıvrılmış-coil etki alanları 10neden bir istikrarsızlık birleştiğinde Oligomerizasyonda 7,9 EFSAM uğrar. Bu yapısal değişiklikler yayınlanmasından sonuçlanan bir bindirme STIM1 ER-PM kavşak 11,12,13,14 PM phosphoinositides 15, ile etkileşimleri aracılığıyla 16 ve Orai1 alt birimleri 17,18. Orai1 forma Ca2 + kanal 19,20,21,22araya PM alt birimleri proteinlerdir. STIM1-Orai1 etkileşimleri ER-PM kavşaklar, Ca2 + yüksek konsantrasyonda üzerinden sitozol içine hareketini sağlayan bir açık Ca2 + aktif yayın Ca2 + (CRAC) kanal uyum kolaylaştırmak Ekstrasellüler boşluk. Bağışıklık hücreleri içinde sürekli sitozolik Ca2 + yükselmeler CRAC kanalları üzerinden Ca2 +– calmodulin/kalsinörin bağımlı dephosphorylation daha sonra çekirdek girer nükleer faktör aktive T-hücrelerinin neden ve T-hücre harekete geçirmek 1,3teşvik genlerin transkripsiyon yönetmelik başlar. Agonist kaynaklı luminal Ca tükenmesi2 + ER via STIM1 23,24 ve elde edilen sürekli sitozolik Ca2 + yükseklik tarafından CRAC kanal etkinleştirme işlemi toplu olarak SOCE 25olarak adlandırılır. SOCE T-hücreleri hayati rol tarafından ağır kombine immün yetmezlik sendromları 3,19,26, STIM1 ve Orai1 kalıtsal mutasyonların neden olabilir gösteren çalışmalar belirgindir 27. EFSAM başlatır SOCE ER luminal Ca2 + tükenmesi kaybı ile Ca2 + koordinasyon kurallı EF-el, sonuçta kendi kendine Derneği istikrarsızlık birleştiğinde 7, önde gelen algılama sonra 28,29.
Glikozilasyon kovalent eki ve işleme oligosakkarit yapıları, olarak da bilinen glukanlardir, ER ve Golgi ( 30,32,33gözden) çeşitli biyosentetik adımlarda var. Glikozilasyon Ökaryotlar iki baskın tür vardır: N-bağlantılı ve O-bağlı, belirli amino asit ve bağlantı köprüleme atom bağlı olarak. N– glikozilasyon, glukanlardir Asn yan zinciri Amid için eklenir ve çoğu durumda, inisiyasyon adım serviste oluşur polipeptid zinciri Lümen 34taşır. Glikoz (Glc), mannoz (adam) ve N– peptidoglikan (GlcNAc) (yani Glc3Man9GlcNAc2) acil servise oluşur On dört-şeker çekirdek yapısı transferini N– glikozilasyon, ilk adımdır membran lipid oligosaccharyltransferase 35,36tarafından. Daha fazla adımlar, bölünme veya glikoz artıkları, transfer gibi acil serviste belirli glycosidases ve glycosyltransferases tarafından katalize. Acil servis bırakın ve Golgi hareket bazı proteinler daha fazla işlenmiş 37olabilir. Glukanlardir, genellikle Ser veya Thr artıkları, yan zinciri hidroksil grubu için ek O– glikozilasyon başvurduğu ve bu değişiklik tamamen Golgi kompleksi 33,34oluşur. Kadar yapılabilir N– peptidoglikan, fucose, galaktoz birkaç O– glycan yapıları ve sialik asit her yaşam ile sırayla 33ekledi.
Hiçbir belirli sıra adl tip-in O– glikozilasyon, için önkoşul olarak tanımlanan süre ortak bir fikir birliği sırası Nile ilişkili olduğu düşünülmektedir-bağlantılı değişiklik: Asn-X-Ser/Thr/nerede X-ebilmek var olmak herhangi bir amino asit Cys, Pro 33. STIM1 EFSAM iki bu fikir birliği N– glikozilasyon sitelerin içerir: Asn131-Trp132-Thr133 ve Asn171-Thr172-Thr173. Gerçekten de, önceki çalışmalar EFSAM N– glikozile 38,39,40,41Asn131 ve Asn171 memeli hücrelerinde olabilir göstermiştir. Ancak, N– glikozilasyon SOCE üzerinde sonuçları önceki çalışmalarda uyumsuz olmuştur, düşündüren bastırılmış, potentiated veya hiçbir etkisi bu translasyonel modifikasyon tarihinde SOCE harekete geçirmek 38, tarafından“xref” = > 39,40,41. Böylece, EFSAM N– glikozilasyon temel biyofiziksel, biyokimyasal ve yapısal sonuçları üzerinde araştırma bu değişiklik düzenleyici etkileri kavrama için hayati önem taşımaktadır. Bu vitro deneyler homojen proteinler yüksek düzeyde gereksinimini nedeniyle kovalent glikoz moieties için EFSAM eklemek için site seçici bir yaklaşım uygulandı. İlginçtir, Asn131 ve Asn171 glikozilasyon içinde EFSAM çekirdek yakınsama ve SOCE STIM1-aracılı 42teşvik biyofiziksel özellikleri geliştirmek yapısal değişiklikler nedeniyle.
Cys thiols kimyasal bağlanma glikosil gruplarının köklü tarafından ilk protein işlevi 43 siteye özgü glikozilasyon etkilerini anlamak için bu enzim-Alerjik yaklaşımın gösterdi seminal bir çalışma oldu , 44. son zamanlarda ve saygı ile STIM1, Asn131 ve Asn171 artıkları için Cys mutasyona uğramış ve glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] kovalent glikoz için ücretsiz thiols 42bağlamak için kullanıldı. Burada, biz sadece mutagenesis site belirli Cys artıkları değişiklik için birleştirmek için kullanır ama çözüm Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi hızla değişiklik verimliliği ve yapısal değerlendirmek için de geçerlidir bu yaklaşım tarif tedirginlikler glikozilasyon bir sonucu olarak. Özellikle, bu genel metodoloji ya O– etkileri çalışmaya kolayca uyarlanabilir veya N– glikozilasyon herhangi recombinantly protein üretilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein glikozilasyon nerede şekerler kovalent polipeptitler öncelikle amino asit yan zincirlerine bağlantıları aracılığıyla eklenen post-translational bir değişiklik olduğunu. Memeli proteinler en çok % 50’si olan glikozile 54, glikozile proteinler daha sonra biyomoleküler bağlama benzeşme değiştirme gelen etkileri çeşitli bir yelpazede içebileceğiniz, katlama, kanal etkinlik değiştirerek, hedefleme protein etkileyen molekülleri bozulması ve hücresel, devletlerde (<sup …
Acknowledgements
Bu araştırma Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada (PBS için 05239), Kanada Vakfı tarafından desteklenmiştir yenilik/Ontario Araştırma Fonu (PBS için) prostat kanseri Vakfı – babama (PBS) ve Ontario Telus gezintiye mücadele Yüksek Lisans Burs (Y.J.C. ve NS).
Materials
| Phusion DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | Use in step 1.3. |
| Generuler 1kb DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1163 | Use in step 1.6. |
| DpnI Restriction Enzyme | New England Biolabs, Inc. | R0176 | Use in step 1.8. |
| Presto Mini Plasmid Kit | GeneAid, Inc. | PDH300 | Use in step 1.16. |
| BL21 DE3 codon (+) E. coli | Agilent Technologies, Inc. | 230280 | Use in step 2.1. |
| DH5a E. coli | Invitrogen, Inc. | 18265017 | Use in step 1.9. |
| 0.22 mm Syringe Filter | Millipore, Inc. | SLGV033RS | Use in step 2.3. |
| HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin | Thermo Fisher Scientific | 88221 | Use in step 3.3. |
| 3,500 Da MWCO Dialysis Tubing | BioDesign, Inc. | D306 | Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6. |
| Bovine Thrombin | BioPharm Laboratories, Inc. | SKU91-055 | Use in step 3.9. |
| 5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column | GE Healthcare, Inc. | 17-5156-01 | Use in step 3.11. |
| Glucose-5-MTS | Toronto Research Chemicals, Inc. | G441000 | Use in step 4.1. |
| Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators | Sartorius, Inc. | VS2001 | Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6. |
| PageRuler Unstained Broad Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26630 | Use in step 3.7, 3.10 and 3.15 |
| HiTrap Q FF Anion Exchange Column | GE Healthcare, Inc. | 17-5053-01 | Use in step 3.12. |
| AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System | GE Healthcare, Inc. | 29018224 | Use in step 3.14. |
| 600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | Use in step 5.2 and 5.5. |
References
- Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).
- Feske, S., Skolnik, E. Y., Prakriya, M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 12 (7), 532-547 (2012).
- Shaw, P. J., Feske, S. Physiological and pathophysiological functions of SOCE in the immune system. Front Biosci (Elite Ed). 4, 2253-2268 (2012).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural aspects of calcium-release activated calcium channel function. Channels (Austin). 7 (5), 344-353 (2013).
- Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structure and function of endoplasmic reticulum STIM calcium sensors. Curr Top Membr. 71, 59-93 (2013).
- Stathopulos, P. B., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ames, J. B., Ikura, M. Stored Ca2+ depletion-induced oligomerization of stromal interaction molecule 1 (STIM1) via the EF-SAM region: An initiation mechanism for capacitive Ca2+ entry. J Biol Chem. 281 (47), 35855-35862 (2006).
- Stathopulos, P. B., Ikura, M. Store operated calcium entry: From concept to structural mechanisms. Cell Calcium. , (2016).
- Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structurally delineating stromal interaction molecules as the endoplasmic reticulum calcium sensors and regulators of calcium release-activated calcium entry. Immunol Rev. 231 (1), 113-131 (2009).
- Muik, M., et al. STIM1 couples to ORAI1 via an intramolecular transition into an extended conformation. EMBO J. 30 (9), 1678-1689 (2011).
- Luik, R. M., Wang, B., Prakriya, M., Wu, M. M., Lewis, R. S. Oligomerization of STIM1 couples ER calcium depletion to CRAC channel activation. Nature. 454 (7203), 538-542 (2008).
- Luik, R. M., Wu, M. M., Buchanan, J., Lewis, R. S. The elementary unit of store-operated Ca2+ entry: local activation of CRAC channels by STIM1 at ER-plasma membrane junctions. J Cell Biol. 174 (6), 815-825 (2006).
- Wu, M. M., Buchanan, J., Luik, R. M., Lewis, R. S. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol. 174 (6), 803-813 (2006).
- Liou, J., Fivaz, M., Inoue, T., Meyer, T. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+ store depletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9301-9306 (2007).
- Calloway, N., et al. Stimulated association of STIM1 and Orai1 is regulated by the balance of PtdIns(4,5)P(2) between distinct membrane pools. J Cell Sci. 124 (Pt 15), 2602-2610 (2011).
- Korzeniowski, M. K., et al. Dependence of STIM1/Orai1-mediated calcium entry on plasma membrane phosphoinositides. J Biol Chem. 284 (31), 21027-21035 (2009).
- Park, C. Y., et al. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. Cell. 136 (5), 876-890 (2009).
- Yuan, J. P., et al. SOAR and the polybasic STIM1 domains gate and regulate Orai channels. Nat Cell Biol. 11 (3), 337-343 (2009).
- Feske, S., et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature. 441 (7090), 179-185 (2006).
- Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
- Vig, M., et al. CRACM1 multimers form the ion-selective pore of the CRAC channel. Curr Biol. 16 (20), 2073-2079 (2006).
- Vig, M., et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Science. 312 (5777), 1220-1223 (2006).
- Liou, J., et al. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Curr Biol. 15 (13), 1235-1241 (2005).
- Roos, J., et al. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol. 169 (3), 435-445 (2005).
- Putney, J. W. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium. 7 (1), 1-12 (1986).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. 460 (2), 417-435 (2010).
- Maus, M., et al. Missense mutation in immunodeficient patients shows the multifunctional roles of coiled-coil domain 3 (CC3) in STIM1 activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6206-6211 (2015).
- Stathopulos, P. B., Zheng, L., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ikura, M. Structural and mechanistic insights into STIM1-mediated initiation of store-operated calcium entry. Cell. 135 (1), 110-122 (2008).
- Stathopulos, P. B., Ikura, M. Partial unfolding and oligomerization of stromal interaction molecules as an initiation mechanism of store operated calcium entry. Biochem Cell Biol. 88 (2), 175-183 (2010).
- Dennis, J. W., Lau, K. S., Demetriou, M., Nabi, I. R. Adaptive regulation at the cell surface by N-glycosylation. Traffic. 10 (11), 1569-1578 (2009).
- Nilsson, T., Au, C. E., Bergeron, J. J. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi apparatus. FEBS Lett. 583 (23), 3764-3769 (2009).
- Stanley, P. Golgi glycosylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (4), (2011).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Gerlach, J., Sharma, S., Leister, K., Joshi, L., Agostinis, P., Afshin, S. . Endoplasmic Reticulum Stress in Health and Disease. , 23-39 (2012).
- Pearse, B. R., Hebert, D. N. Lectin chaperones help direct the maturation of glycoproteins in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 684-693 (2010).
- Stanley, P., Sundaram, S. Rapid assays for lectin toxicity and binding changes that reflect altered glycosylation in mammalian cells. Curr Protoc Chem Biol. 6 (2), 117-133 (2014).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Csutora, P., et al. Novel role for STIM1 as a trigger for calcium influx factor production. J Biol Chem. 283 (21), 14524-14531 (2008).
- Kilch, T., et al. Mutations of the Ca2+-sensing stromal interaction molecule STIM1 regulate Ca2+ influx by altered oligomerization of STIM1 and by destabilization of the Ca2+ channel Orai1. J Biol Chem. 288 (3), 1653-1664 (2013).
- Williams, R. T., et al. Stromal interaction molecule 1 (STIM1), a transmembrane protein with growth suppressor activity, contains an extracellular SAM domain modified by N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta. 1596 (1), 131-137 (2002).
- Mignen, O., Thompson, J. L., Shuttleworth, T. J. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. 579 (Pt 3), 703-715 (2007).
- Choi, Y. J., Zhao, Y., Bhattacharya, M., Stathopulos, P. B. Structural perturbations induced by Asn131 and Asn171 glycosylation converge within the EFSAM core and enhance stromal interaction molecule-1 mediated store operated calcium entry. Biochim Biophys Acta. 1864 (6), 1054-1063 (2017).
- Davis, B. G., Lloyd, R. C., Jones, J. B. Controlled site-selective protein glycosylation for precise glycan structure-catalytic activity relationships. Bioorg Med Chem. 8 (7), 1527-1535 (2000).
- Gamblin, D. P., van Kasteren, S. I., Chalker, J. M., Davis, B. G. Chemical approaches to mapping the function of post-translational modifications. FEBS J. 275 (9), 1949-1959 (2008).
- Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Methods Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Bell, D. J. Mass spectrometry. Methods Mol Biol. 244, 447-454 (2004).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Farrow, N. A., et al. Backbone Dynamics of a Free and a Phosphopeptide-Complexed Src Homology-2 Domain Studied by N-15 Nmr Relaxation. Biochemistry. 33 (19), 5984-6003 (1994).
- Kay, L. E., Keifer, P., Saarinen, T. Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity. Journal of the American Chemical Society. 114 (26), 10663-10665 (1992).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Masse, J. E., Keller, R. AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic. J Magn Reson. 174 (1), 133-151 (2005).
- Monticelli, M., Ferro, T., Jaeken, J., Dos Reis Ferreira, V., Videira, P. A. Immunological aspects of congenital disorders of glycosylation (CDG): a review. J Inherit Metab Dis. 39 (6), 765-780 (2016).
- An, H. J., Kronewitter, S. R., de Leoz, M. L., Lebrilla, C. B. Glycomics and disease markers. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 601-607 (2009).
- Wani, W. Y., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V., McMahon, L. L., Zhang, J. O-GlcNAcylation and neurodegeneration. Brain Res Bull. , (2016).
- Haines, A. M., Tobe, S. S., Kobus, H. J., Linacre, A. Properties of nucleic acid staining dyes used in gel electrophoresis. Electrophoresis. 36 (6), 941-944 (2015).
