JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Cysteïne thiolen richtend voor in Vitro site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten

Published: October 04, 2017
doi:
10.3791/56302
, , , , ,
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry,University of Western Ontario

Summary

Biochemische en structurele analyses van geglycosyleerde eiwitten vereist relatief grote hoeveelheden van homogene monsters. Hier presenteren we een efficiënte chemische methode voor site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten gezuiverd van bacteriën door zich te richten van reactieve Cys thiolen.

Abstract

Stromale interactie molecuul-1 (STIM1) is een type-ik transmembraan eiwit gelegen aan het endoplasmatisch reticulum (ER) en plasma membranen (PM). ER-ingezeten STIM1 regelt de activiteit van PM Orai1 kanalen in een proces dat bekend staat als bediende calcium (Ca2 +)-vermelding die is het belangrijkste Ca2 + signalering proces dat de immuunrespons drijft opslaan. STIM1 ondergaat posttranslationele N– glycosylation op twee luminal Asn sites binnen het Ca2 + sensing domein van het molecuul. Echter de biochemische, biofysische, en de biologische effecten van de structuur van N– geglycosyleerde STIM1 waren slecht begrepen totdat onlangs als gevolg van een onvermogen om gemakkelijk verkrijgen van hoge niveaus van homogene N– geglycosyleerde proteïne. Hier beschrijven we de uitvoering van een in vitro chemische aanpak die glucose wordt naar specifieke proteïne sites die van toepassing zijn hecht voor het begrip van de onderliggende effecten van N– glycosylation op eiwitstructuur en mechanisme. Met behulp van de oplossing nucleaire magnetische resonantie spectroscopie beoordelen we beide efficiëntie van de wijziging alsook de structurele gevolgen van de bijlage van de glucose met een enkelvoudige steekproef. Deze aanpak kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van de talloze geglycosyleerde eiwitten in de natuur aangetroffen.

Introduction

Opslaan van bediende calcium (Ca2 +) post (SOCE) is de grote pad waarop immuuncellen Ca2 + van de extracellulaire ruimte in het cytosol duren. In T lymfocyten binding T-cel-receptoren gelegen op het plasma-membraan (PM) antigenen die eiwit tyrosine kinases activeren (herzien in 1,2,3). Een cascade van fosforylering leidt tot de activering van fosfolipase-γ (PLCγ) die vervolgens doorgeeft van de hydrolyse van membraan phosphatidylinositol 4,5-difosfaat (PIP2) in diacylglycerol en inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-3 ). IP-3 is een kleine diffusible boodschapper dat aan IP-3 receptoren (IP-3R) op het endoplasmatisch reticulum (ER) waardoor deze receptor-kanaal opent en toelaat Ca2 + bindt aan de gradiënt van de concentratie van de ER stromen lumen naar het cytosol (herzien in 4). Receptor signalering van G-eiwit gekoppelde en tyrosine kinase receptoren in een verscheidenheid van andere prikkelbaar en niet-prikkelbaar cel typen lood op de dezelfde productie van IP-3 en activering van IP-3Rs.

Als gevolg van de eindige Ca2 + opslagcapaciteit van de ER, de IP-3-gemedieerde release en resulterende toename van cytosolische Ca2 + is alleen voorbijgaande; echter deze uitputting van de ER luminal Ca2 + diep gevolgen stromale interactie molecuul-1 (STIM1), een type-ik transmembraan (TM) eiwit meestal aangetroffen op de ER membraan 5,6,7. STIM1 bevat een lumen-georiënteerde Ca2 + sensing domein bestaat uit een paar van de EF-hand en steriele α-motief (EFSAM). Drie cytosolische georiënteerde spiraalsnoer-spoel domeinen zijn gescheiden van de EFSAM door de één TM domein (herzien in 8). Na ER luminal Ca2 + uitputting ondergaat EFSAM een destabilisatie-coupled oligomerisatie 7,9 waardoor structurele herschikkingen van de TM en spiraalsnoer-spoel domeinen 10. Deze structurele veranderingen uitmonden in een overlapping van STIM1 bij ER-PM kruispunten 11,12,13,14 door middel van interacties met PM-phosphoinositides 15, 16 en Orai1 subeenheden 17,18. Orai1 eiwitten zijn de PM subeenheden die aan formulier Ca2 + kanalen 19,20,21,22 monteren. De STIM1-Orai1-interacties bij ER-PM kruisingen vergemakkelijken een open Ca2 + versie geactiveerd Ca2 + (CRAC) kanaal conformatie waarmee het verkeer van Ca2 + in het cytosol door de hoge concentraties van de extracellulaire ruimte. In de immuun cellen, de aanhoudende cytosolische Ca2 + waterstand via CRAC kanalen veroorzaken de Ca2 +– Calmoduline/calcineurin afhankelijke defosforylerings van de nucleaire factor van geactiveerde T-cellen, die vervolgens de kern en begint transcriptionele verordening van genen bevordering van T-cel activatie 1,3. Het proces van de CRAC kanaal activering door STIM1 23,24 via agonist-geïnduceerde ER luminal Ca2 + uitputting en de resulterende aanhoudende cytosolische Ca2 + elevatie wordt collectief SOCE 25genoemd. De vitale rol van SOCE in T-cellen is duidelijk door de onderzoeken die aantonen dat erfelijke mutaties in zowel STIM1 als Orai1 leiden strenge gecombineerde immunodeficiency syndromen 3,19,26, tot kunnen 27. EFSAM start SOCE na sensing ER-luminal Ca2 + uitputting via het verlies van Ca2 + coördinatie op de canonieke EF-hand, dat uiteindelijk leidde tot de destabilisatie-coupled zelfstandige vereniging 7, 28,29.

Glycosylatie is de covalente gehechtheid en de verwerking van oligosaccharide structuren, ook bekend als glycanen, door verschillende biosynthetic stappen in de ER en Golgi (herzien in3332, 30,). Er zijn twee dominante soorten glycosylatie in eukaryoten: N-gekoppelde en O-gekoppeld, afhankelijk van de specifieke aminozuur en Atoom het overbruggen van de koppeling. N– glycosylation, glycanen zijn bevestigd aan de kant keten amide van Asn, en in de meeste gevallen de inleiding stap vindt plaats in de ER als de polypeptide keten pakt de lumen- 34. De eerste stap van N– glycosylation is de overdracht van een veertien-suiker kern structuur bestaande uit glucose (Glc), mannose (Man) en N– acetylglucosamine (GlcNAc) (d.w.z. Glc3Man9GlcNAc2) van een ER membraan lipide door een oligosaccharyltransferase 35,36. Verdere stappen, zoals splitsing of overdracht van glucose residuen, zijn in de ER gekatalyseerd door specifieke glycosidases en glycosyltransferases. Sommige eiwitten die ER verlaten en verhuizen naar het Golgi kunnen verder verwerkte 37te zijn. O– glycosylation verwijst naar de toevoeging van glycanen, meestal aan de kant keten hydroxylgroep van Ser of Thr residuen, en deze wijziging gebeurt volledig in het Golgi-complex 33,34. Er zijn verschillende structuren van het O– glycan die kunnen worden samengesteld uit N– acetylglucosamine fucose, galactose en sialic zuur met elke monosaccharide toegevoegd sequentieel 33.

Terwijl zonder specifieke volgorde is geïdentificeerd als voorwaarde voor vele soorten O– glycosylation, een gemeenschappelijke reeks van consensus is in verband gebracht met de N-wijziging gekoppeld: Asn-X-Ser/Thr/Cys, waarbij X een aminozuur kan zijn behalve Pro 33. STIM1 EFSAM bevat twee van deze consensus N– glycosylation sites: Asn131-Trp132-Thr133 en Asn171-Thr172-Thr173. Inderdaad, vorige studies hebben aangetoond dat EFSAM N– geglycosyleerde bij zoogdiercellen op Asn131 en Asn171 38,39,40,41kan zijn. Eerdere studies van de gevolgen van de N– glycosylation op SOCE geweest elkaar echter suggereren onderdrukt, Potentiation of geen effect door deze posttranslationele wijziging op SOCE activering 38,= “xref” > 39,40,41. Onderzoek over de onderliggende biofysische, biochemische en structurele gevolgen van EFSAM N– glycosylation is dus van vitaal belang voor het begrijpen van de regelgevende gevolgen van deze wijziging. Als gevolg van de eis van hoge niveaus van homogene eiwitten in deze in vitro experimenten, werd een site-selectieve benadering hechten covalent glucose wordt aan EFSAM toegepast. Interessant, veroorzaakt Asn131 en Asn171 glycosylatie structurele veranderingen die convergeren in de kern van de EFSAM en de biofysische eigenschappen ter bevordering van STIM1-gemedieerde SOCE 42te verbeteren.

De chemische bevestiging van glycosyl groepen aan Cys thiolen geweest gevestigde door een baanbrekende werk die eerst gedemonstreerd het nut van dit enzym-vrije benadering voor het begrip van de specifieke effecten van glycosylatie op eiwit functie 43 , 44. meer recentelijk als ten aanzien van STIM1, de Asn131 en Asn171 residuen waren gemuteerd naar Cys en glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] werd gebruikt om covalent glucose te koppelen aan de gratis thiolen 42. Hier beschrijven we deze aanpak die niet alleen mutagenese gebruikt te nemen site specifieke Cys residuen voor wijziging, maar geldt ook oplossing nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie om te snel beoordelen van zowel de efficiëntie van de wijziging en de structurele verstoringen als gevolg van de glycosylatie. Met name deze algemene methodologie is gemakkelijk aan te passen aan het bestuderen van de effecten van beide O– of N– glycosylation van om het even welk recombinantly eiwit geproduceerd.

Protocol

1. polymerase-kettingreactie (PCR)-gemedieerde plaats-geleide mutagenese voor de opneming van Cys in een vector van de expressie bacteriële huisdier-28a. Bepaal de concentratie van het huisdier-28a vector (d.w.z. dubbele gestrande DNA) met behulp van ultraviolet (UV) uitsterven coëfficiënt 0.020 (μg/mL) cm -1 op 260 nm. Synthetiseren een paar aanvullende mutagene inleidingen voor elke Cys mutatie die ik) Er dienen minimaal 15 nucleotiden ter aanvulling van de sjabloon voorafga…

Representative Results

De eerste stap van deze aanpak vereist de mutagenese van de kandidaat-glycosylation residuen Cys residuen die kunnen worden gewijzigd met behulp van de EFSAM glucose-5-MTS. heeft geen endogene Cys residuen, dus geen speciale overwegingen moeten worden gemaakt voorafgaand aan de mutagenese. Native Cys residuen moeten echter worden gemuteerd naar niet-wijzigbare residuen vóór het uitvoeren van de beschreven chemie. Om minimaal de inheemse structuur in te voeren, is het raadzaam voor het u…

Discussion

Eiwit glycosylatie is een posttranslationele wijziging waar suikers covalent aan polypeptiden voornamelijk door middel van banden met aminozuur zijketens zijn gekoppeld. Maar liefst 50% van de zoogdieren eiwitten zijn geglycosyleerde 54, waar de geglycosyleerde eiwitten kunnen vervolgens hebben een breed scala aan effecten wijzigen biomoleculaire bindende affiniteit, beïnvloeden van eiwit vouwen, veranderen van kanaal activiteit, gericht op moleculen voor afbraak en mobiele handel, een paar (herz…

Acknowledgements

Dit onderzoek werd gesteund door de natuurwetenschappen en de Engineering Research Council of Canada (05239 tot P.B.S.), de Canadese basis voor innovatie/Ontario onderzoeksfonds (aan P.B.S.), Prostate kanker bestrijden Foundation – Telus Ride voor Papa (aan P.B.S.) en Ontario Afgestudeerde beurs (aan Y.J.C. en N.S.).

Materials

Phusion DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530S Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific FERSM1163 Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme New England Biolabs, Inc. R0176 Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit GeneAid, Inc. PDH300 Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli Agilent Technologies, Inc. 230280 Use in step 2.1.
DH5a E. coli Invitrogen, Inc. 18265017 Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter Millipore, Inc. SLGV033RS Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin Thermo Fisher Scientific 88221 Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing BioDesign, Inc. D306 Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin BioPharm Laboratories, Inc. SKU91-055 Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5156-01 Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS Toronto Research Chemicals, Inc. G441000 Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators Sartorius, Inc. VS2001 Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26630 Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5053-01 Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System GE Healthcare, Inc. 29018224 Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer Agilent Technologies, Inc. Use in step 5.2 and 5.5.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).
  2. Feske, S., Skolnik, E. Y., Prakriya, M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 12 (7), 532-547 (2012).
  3. Shaw, P. J., Feske, S. Physiological and pathophysiological functions of SOCE in the immune system. Front Biosci (Elite Ed). 4, 2253-2268 (2012).
  4. Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
  5. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural aspects of calcium-release activated calcium channel function. Channels (Austin). 7 (5), 344-353 (2013).
  6. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structure and function of endoplasmic reticulum STIM calcium sensors. Curr Top Membr. 71, 59-93 (2013).
  7. Stathopulos, P. B., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ames, J. B., Ikura, M. Stored Ca2+ depletion-induced oligomerization of stromal interaction molecule 1 (STIM1) via the EF-SAM region: An initiation mechanism for capacitive Ca2+ entry. J Biol Chem. 281 (47), 35855-35862 (2006).
  8. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Store operated calcium entry: From concept to structural mechanisms. Cell Calcium. , (2016).
  9. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structurally delineating stromal interaction molecules as the endoplasmic reticulum calcium sensors and regulators of calcium release-activated calcium entry. Immunol Rev. 231 (1), 113-131 (2009).
  10. Muik, M., et al. STIM1 couples to ORAI1 via an intramolecular transition into an extended conformation. EMBO J. 30 (9), 1678-1689 (2011).
  11. Luik, R. M., Wang, B., Prakriya, M., Wu, M. M., Lewis, R. S. Oligomerization of STIM1 couples ER calcium depletion to CRAC channel activation. Nature. 454 (7203), 538-542 (2008).
  12. Luik, R. M., Wu, M. M., Buchanan, J., Lewis, R. S. The elementary unit of store-operated Ca2+ entry: local activation of CRAC channels by STIM1 at ER-plasma membrane junctions. J Cell Biol. 174 (6), 815-825 (2006).
  13. Wu, M. M., Buchanan, J., Luik, R. M., Lewis, R. S. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol. 174 (6), 803-813 (2006).
  14. Liou, J., Fivaz, M., Inoue, T., Meyer, T. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+ store depletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9301-9306 (2007).
  15. Calloway, N., et al. Stimulated association of STIM1 and Orai1 is regulated by the balance of PtdIns(4,5)P(2) between distinct membrane pools. J Cell Sci. 124 (Pt 15), 2602-2610 (2011).
  16. Korzeniowski, M. K., et al. Dependence of STIM1/Orai1-mediated calcium entry on plasma membrane phosphoinositides. J Biol Chem. 284 (31), 21027-21035 (2009).
  17. Park, C. Y., et al. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. Cell. 136 (5), 876-890 (2009).
  18. Yuan, J. P., et al. SOAR and the polybasic STIM1 domains gate and regulate Orai channels. Nat Cell Biol. 11 (3), 337-343 (2009).
  19. Feske, S., et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature. 441 (7090), 179-185 (2006).
  20. Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
  21. Vig, M., et al. CRACM1 multimers form the ion-selective pore of the CRAC channel. Curr Biol. 16 (20), 2073-2079 (2006).
  22. Vig, M., et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Science. 312 (5777), 1220-1223 (2006).
  23. Liou, J., et al. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Curr Biol. 15 (13), 1235-1241 (2005).
  24. Roos, J., et al. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol. 169 (3), 435-445 (2005).
  25. Putney, J. W. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium. 7 (1), 1-12 (1986).
  26. Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. 460 (2), 417-435 (2010).
  27. Maus, M., et al. Missense mutation in immunodeficient patients shows the multifunctional roles of coiled-coil domain 3 (CC3) in STIM1 activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6206-6211 (2015).
  28. Stathopulos, P. B., Zheng, L., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ikura, M. Structural and mechanistic insights into STIM1-mediated initiation of store-operated calcium entry. Cell. 135 (1), 110-122 (2008).
  29. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Partial unfolding and oligomerization of stromal interaction molecules as an initiation mechanism of store operated calcium entry. Biochem Cell Biol. 88 (2), 175-183 (2010).
  30. Dennis, J. W., Lau, K. S., Demetriou, M., Nabi, I. R. Adaptive regulation at the cell surface by N-glycosylation. Traffic. 10 (11), 1569-1578 (2009).
  31. Nilsson, T., Au, C. E., Bergeron, J. J. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi apparatus. FEBS Lett. 583 (23), 3764-3769 (2009).
  32. Stanley, P. Golgi glycosylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (4), (2011).
  33. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  34. Gerlach, J., Sharma, S., Leister, K., Joshi, L., Agostinis, P., Afshin, S. . Endoplasmic Reticulum Stress in Health and Disease. , 23-39 (2012).
  35. Pearse, B. R., Hebert, D. N. Lectin chaperones help direct the maturation of glycoproteins in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 684-693 (2010).
  36. Stanley, P., Sundaram, S. Rapid assays for lectin toxicity and binding changes that reflect altered glycosylation in mammalian cells. Curr Protoc Chem Biol. 6 (2), 117-133 (2014).
  37. Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
  38. Csutora, P., et al. Novel role for STIM1 as a trigger for calcium influx factor production. J Biol Chem. 283 (21), 14524-14531 (2008).
  39. Kilch, T., et al. Mutations of the Ca2+-sensing stromal interaction molecule STIM1 regulate Ca2+ influx by altered oligomerization of STIM1 and by destabilization of the Ca2+ channel Orai1. J Biol Chem. 288 (3), 1653-1664 (2013).
  40. Williams, R. T., et al. Stromal interaction molecule 1 (STIM1), a transmembrane protein with growth suppressor activity, contains an extracellular SAM domain modified by N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta. 1596 (1), 131-137 (2002).
  41. Mignen, O., Thompson, J. L., Shuttleworth, T. J. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. 579 (Pt 3), 703-715 (2007).
  42. Choi, Y. J., Zhao, Y., Bhattacharya, M., Stathopulos, P. B. Structural perturbations induced by Asn131 and Asn171 glycosylation converge within the EFSAM core and enhance stromal interaction molecule-1 mediated store operated calcium entry. Biochim Biophys Acta. 1864 (6), 1054-1063 (2017).
  43. Davis, B. G., Lloyd, R. C., Jones, J. B. Controlled site-selective protein glycosylation for precise glycan structure-catalytic activity relationships. Bioorg Med Chem. 8 (7), 1527-1535 (2000).
  44. Gamblin, D. P., van Kasteren, S. I., Chalker, J. M., Davis, B. G. Chemical approaches to mapping the function of post-translational modifications. FEBS J. 275 (9), 1949-1959 (2008).
  45. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Methods Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  46. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Bell, D. J. Mass spectrometry. Methods Mol Biol. 244, 447-454 (2004).
  49. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  50. Farrow, N. A., et al. Backbone Dynamics of a Free and a Phosphopeptide-Complexed Src Homology-2 Domain Studied by N-15 Nmr Relaxation. Biochemistry. 33 (19), 5984-6003 (1994).
  51. Kay, L. E., Keifer, P., Saarinen, T. Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity. Journal of the American Chemical Society. 114 (26), 10663-10665 (1992).
  52. Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  53. Masse, J. E., Keller, R. AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic. J Magn Reson. 174 (1), 133-151 (2005).
  54. Monticelli, M., Ferro, T., Jaeken, J., Dos Reis Ferreira, V., Videira, P. A. Immunological aspects of congenital disorders of glycosylation (CDG): a review. J Inherit Metab Dis. 39 (6), 765-780 (2016).
  55. An, H. J., Kronewitter, S. R., de Leoz, M. L., Lebrilla, C. B. Glycomics and disease markers. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 601-607 (2009).
  56. Wani, W. Y., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V., McMahon, L. L., Zhang, J. O-GlcNAcylation and neurodegeneration. Brain Res Bull. , (2016).
  57. Haines, A. M., Tobe, S. S., Kobus, H. J., Linacre, A. Properties of nucleic acid staining dyes used in gel electrophoresis. Electrophoresis. 36 (6), 941-944 (2015).

Tags

Cysteine ThiolsSite-specific GlycosylationRecombinant ProteinsStructural BiologyGlycosylation PatternsDisease TherapyPCR MutagenesisDPN1 DigestionProtein Expression
check_url/56302?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S., Siddiqui, N., Feng, Q., Stathopulos, P. B. Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. (128), e56302, doi:10.3791/56302 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image