מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים

Summary

ניתוחים הביוכימי ומבניים של חלבונים glycosylated דורשים כמויות גדולות יחסית של דגימות הומוגנית. כאן, אנו מציגים שיטה כימית יעילה עבור גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים מטוהרים של חיידקים על ידי מיקוד תיולים Cys תגובתי.

Abstract

האינטראקציה סטרומה מולקולה-1 (STIM1) הוא סוג-אני טראנסממברנלי הממוקם על רשתית תוך-פלזמית (ER), ממברנות פלזמה (PM). ER-תושב STIM1 מווסת את הפעילות של ערוצי PM Orai1 בתהליך המכונה תאחסן המופעלים סידן (Ca^{2 +}) זהו המנהל Ca^{2 +} איתות התהליך שמניע את התגובה החיסונית. STIM1 עובר post-translational N– גליקוזילציה בשני אתרים Asn luminal בתוך Ca^{2 +} חישה תחום של המולקולה. עם זאת, הביוכימי, biophysical, מבנה השפעות ביולוגיות של N– glycosylated STIM1 היו ממעטים להבין עד לאחרונה עקב חוסר יכולת להשיג בקלות רמות גבוהות של חלבון – glycosylated Nהומוגנית. כאן, אנו מתארים מימוש במבחנה כימית גישה שמתחבר גלוקוז moieties לאתרים חלבון ספציפי, החלים על הבנת ההשפעות הבסיסית של N– גליקוזילציה על מבנה החלבון ואת מנגנון. באמצעות פתרון תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה לנו להעריך הן יעילות של השינוי, כמו גם את ההשלכות מבנית של הקובץ המצורף גלוקוז עם דוגמה אחת. גישה זו ניתן להתאים בקלות ללמוד את החלבונים glycosylated הרבות המצויים בטבע.

Introduction

לאחסן המופעלים סידן (Ca^{2 +}) כניסה (SOCE) הוא מסלול מרכזי שבו תאים חיסוניים לקחת את^{2 +} Ca מן המרחב חוץ-תאית לתוך ציטוזול. בלימפוציטים מסוג T, T cell קולטנים הממוקמים על קרום פלזמה (PM) לאגד אנטיגנים אשר להפעיל חלבון טירוזין kinases (נבדקה ^1,2,3). מפל זרחון שמוביל ההפעלה של phospholipase-γ (PLCγ) אשר לאחר מכן שמתווכת של הידרוליזה של הממברנה phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (פיפ₂) לתוך diacylglycerol, אינוזיטול 1,4,5-טריפוספט (IP₃ ). IP₃ הוא שליח diffusible קטן אשר נקשר לקולטנים IP₃ (IP₃R) על תוך-פלזמית (ER) ובכך לפתוח ערוץ קולטן זה ואישורים Ca^{2 +} לזרום במורד מעבר הצבע ריכוז מחדר המיון לומן ל ציטוזול (נבדקה ב ⁴). קולטן למנהיגנו לבין חלבון G בשילוב קולטני טירוזין קינאז במגוון של עופרת סוגים אחרים על טמפרמנט רב ועל אי-טמפרמנט תא ייצור זהה של IP₃ והפעלה של IP₃ר’.

עקב גבולית קה^{2 +} קיבולת האחסון של חדר המיון, ה-IP₃-שחרור בתיווך, שנפתח על ידי עלייה Ca cytosolic^{2 +} היא רק ארעי; עם זאת, זו דלדול ER luminal Ca^{2 +} עמוקות אפקטים אינטראקציה סטרומה מולקולה-1 (STIM1), סוג-אני transmembrane (TM) חלבון נמצאו בעיקר על^{6,7 5,}ממברנה ER. STIM1 מכיל מונחה לומן Ca^{2 +} חישה תחום מורכב, זוג EF-יד ו α-מוטיב סטרילי (EFSAM). שלושה תחומים של סליל מפותל cytosolic מונחה מופרדים EFSAM על-ידי קבוצת המחשבים TM יחיד (נבדקה ב ⁸). בעת מיון luminal Ca^{2 +} התרוקנות, עובר EFSAM ^7,oligomerization מצמידים הקשורה⁹ הגורמת rearrangements מבנית של TM ואת סליל מפותל תחומים ¹⁰. שינויים מבניים אלה מסתיימים השמנה של STIM1 ב ER-PM צמתי ^11,12,13,14 דרך אינטראקציות עם PM phosphoinositides ^{15, 16} Orai1 subunits ^17,18. Orai1 חלבונים הם subunits PM אשר להרכיב לטופס Ca^{2 +} ערוצי ^19,20,21,22. האינטראקציות STIM1-Orai1 ובצמתים ER-PM להקל על פתוח Ca^{2 +} שחרור מופעל Ca^{2 +} (CRAC) ערוץ קונפורמציה המאפשר את התנועה של Ca^{2 +} לתוך ציטוזול מ ריכוזים גבוהים של מרחב חוץ-תאית. בתאי מערכת החיסון, מתמשכת cytosolic Ca^{2 +} שינויי הגובה באמצעות ערוצים CRAC זירוז של Ca^{2 +}– קלמודולין/calcineurin תלויים dephosphorylation של הגורם הגרעיני של תאי-T מופעל, אשר לאחר מכן נכנס לגרעין, מתחיל תעתיק ויסות גנים קידום T-cell הפעלה ^1,3. התהליך של CRAC הפעלת הערוץ על ידי ^23,STIM1²⁴ באמצעות אגוניסט-induced ER luminal Ca^{2 +} הידלדלות שכבת שתיווצר מתמשכת cytosolic Ca^{2 +} גובה קולקטיבי הנקרא SOCE ²⁵. התפקיד החיוני של SOCE של תאי T-מתבטא על ידי מחקרים מדגימים כי מוטציות heritable הן STIM1 והן Orai1 יכול לגרום כשל חיסוני משולבים severe תסמונות ^{3,19,26, 27}. EFSAM יוזם SOCE לאחר חישה Ca ER-luminal^{2 +} דלדול דרך האובדן של Ca^{2 +} תיאום הקנוני EF-היד, המוביל בסופו של דבר האגודה עצמית מצמידים הקשורה ^{7, 28,29}.

גליקוזילציה הוא מצורף קוולנטיות עיבוד של פחמימה # מיון הפחמימות מבנים, הידוע גם בשם glycans, דרך השלבים השונים biosynthetic הוחלף נגזר ER, גולג’י (נבדקה ב ^30,32,33). ישנם שני סוגי גליקוזילציה ב פרוקריוטים השולט: N-המקושר ו- O-מקושרים, בהתאם חומצת אמינו ספציפית אטום גישור ניגודים. ב- N– גליקוזילציה, glycans מחוברים את אמיד שרשרת הצד של Asn, ברוב המקרים, שלב החניכה מתרחשת בחדר המיון כמו מפוליפפטיד שרשרת נע לתוך לומן ³⁴. הצעד הראשון גליקוזילציה – Nהוא ההעברה של מבנה ליבה 14-סוכר המורכב גלוקוז (Glc), מנוז (אדם) ו- N– acetylglucosamine (GlcNAc) (קרי Glc₃איש₉GlcNAc₂) ממיון ממברנה השומנים על ידי ^35,oligosaccharyltransferase³⁶. צעדים נוספים, כגון מחשוף או העברה של גלוקוז משקעים, הן מזורז בחדר המיון glycosidases ספציפיות, glycosyltransferases. כמה חלבונים להשאיר בחדר המיון ולהעביר גולג’י יכול להיות עוד יותר מעובד ³⁷. O– גליקוזילציה מתייחס התוספת של glycans, בדרך כלל אל קבוצת הידרוקסיל שרשרת הצד של שאריות Ser או חמישי, ומתרחשת שינוי זה לחלוטין ב ^33,הגולגי³⁴. ישנם מספר מבנים – glycan Oאשר יכול להיות מורכב של N– acetylglucosamine, fucose, גלקטוז, חומצה sialic עם כל חד-סוכר נוסף ברצף ³³.

אמנם אין רצף מסוים זוהה תנאי הכרחי עבור סוגים רבים של O– גליקוזילציה, רצף קונצנזוס נפוצות נמצא קשור N-מקושרים השינוי: Asn-X-Ser/חמישי/Cys, שבו X יכול להיות כל חומצת אמינו רק Pro ³³. STIM1 EFSAM מכיל את שני האתרים האלה – גליקוזילציה קונצנזוס N: Asn131-Trp132-Thr133 ו- Asn171-Thr172-Thr173. ואכן, מחקרים קודמים הראו כי EFSAM יכול להיות N– glycosylated בתרבית של תאים ב- Asn131 ו- Asn171 ^38,39,40,41. עם זאת, מחקרים קודמים ההשלכות של N– גליקוזילציה על SOCE היו incongruent, רומז מדוכא, potentiated או אין השפעה על ידי שינוי זה post-translational על SOCE ההפעלה ^38,= “xref” >^40,,39⁴¹. לפיכך, מחקר על ההשלכות biophysical, ביוכימי, מבניים הבסיסית של EFSAM N– גליקוזילציה חיוני כדי לגלות את ההשפעות הרגולציה של שינוי זה. עקב הדרישה לקבלת רמות גבוהות של חלבונים הומוגנית בניסויים אלה במבחנה , הוחל בגישה סלקטיבית באתר לצרף covalently גלוקוז moieties EFSAM. מעניין, Asn131 ו- Asn171 גליקוזילציה גרם לשינויים מבניים להתכנס בתוך תוכו EFSAM ולשפר את המאפיינים biophysical אשר לקדם בתיווך STIM1 SOCE ⁴².

הקובץ המצורף כימי של קבוצות glycosyl כדי Cys תיולים כבר ומבוססת על ידי עבודה הזרע אשר שהראו את התועלת של גישה זו ללא אנזים להבנת השפעת גליקוזילציה בייעודי לאתר על תפקוד החלבון ^{43 , 44}. לאחרונה, ובעניין STIM1, משקעי Asn131 ו- Asn171 היו מוטציה כדי Cys ושימש glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] כדי covalently לקישור גלוקוז חופשי תיולים ⁴². כאן, אנו מתארים גישה זו, אשר לא רק משתמשת מוטגנזה מכוונת לשלב באתר ספציפי Cys שאריות ולשנותן, אלא חל גם פתרון ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית (NMR) להעריך במהירות יעילות שינויים מבניים לפליטת כתוצאה גליקוזילציה. ראוי לציין, מתודולוגיה כללית זו ניתנת להתאמה בקלות לחקור את ההשפעות של או O– או N– גליקוזילציה של כל recombinantly מיוצר חלבון.

Protocol

1. תגובת שרשרת פולימראזית (PCR)-מתווכת מוטגנזה כהכנה לסיפוח Cys לתוך וקטור ביטוי חיידקי pET-28a. לקבוע את הריכוז של הווקטור pET-28a (כלומר כפול נטושים DNA) באמצעות מקדם הכחדה אולטרה סגול (UV) (μg/mL) 0.020 ס מ -1 ב 260 ננומטר. לסנתז זוג תחל מוטגניות משלימים עבור כל מוטציה Cys כזה כי אני) יש מיני…

Representative Results

הצעד הראשון של גישה זו מחייבת מוטגנזה מכוונת של שאריות גליקוזילציה המועמד אל שאריות Cys אשר ניתן לשינוי באמצעות EFSAM של גלוקוז-5-MTS. יש ללא שאריות Cys אנדוגני, אז אין שיקולים מיוחדים צריכים להיעשות לפני מוטגנזה מכוונת. עם זאת, שאריות Cys יליד חייב להיות מוטציה כדי משקעים שאינם לש…

Discussion

גליקוזילציה חלבון הוא שינוי post-translational איפה סוכרים covalently מחוברים polypeptides בעיקר דרך קישורים לרשתות בצד חומצת אמינו. כ 50% של יונקים חלבונים הם glycosylated ⁵⁴, שבו החלבונים glycosylated יכול לאחר מכן יש מגוון רחב של אפקטים מתוך שינוי זיקה מחייבת למערכות ביולוגיות, המשפיעים על חלבון קיפול, שינ?…

Materials

Phusion DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific	F530S	Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	FERSM1163	Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme	New England Biolabs, Inc.	R0176	Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit	GeneAid, Inc.	PDH300	Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli	Agilent Technologies, Inc.	230280	Use in step 2.1.
DH5a E. coli	Invitrogen, Inc.	18265017	Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter	Millipore, Inc.	SLGV033RS	Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin	Thermo Fisher Scientific	88221	Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing	BioDesign, Inc.	D306	Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin	BioPharm Laboratories, Inc.	SKU91-055	Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column	GE Healthcare, Inc.	17-5156-01	Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS	Toronto Research Chemicals, Inc.	G441000	Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators	Sartorius, Inc.	VS2001	Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26630	Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column	GE Healthcare, Inc.	17-5053-01	Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System	GE Healthcare, Inc.	29018224	Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer	Agilent Technologies, Inc.		Use in step 5.2 and 5.5.