Dirigida a tioles de la cisteína para in Vitro específica glicosilación de proteínas recombinantes

Resumen

Análisis bioquímicos y estructurales de proteínas glicosiladas requieren cantidades relativamente grandes de muestras homogéneas. Aquí, presentamos un método químico eficiente para el glycosylation sitio-específico de proteínas recombinantes purificados de bacterias dirigiéndose a tioles reactivos de Cys.

Resumen

Interacción stromal molecule-1 (STIM1) es un tipo-yo proteína transmembrana localizado en el retículo endoplásmico (ER) y membranas del plasma (PM). ER-residente STIM1 regula la actividad de PM Orai1 canales en un proceso conocido como tienda de entrada operado de calcio (Ca^{2 +}) que es el principal Ca^{2 +} proceso de señalización que conduce a la respuesta inmune. STIM1 se somete poste-de translación N- glicosilación en dos sitios de Asn luminales en el Ca^{2 +} detección del dominio de la molécula. Sin embargo, los bioquímicos, biofísicos, y efectos biológicos de la estructura de N- glicosilada STIM1 fueron mal entendidos hasta recientemente debido a una incapacidad para obtener rápidamente altos niveles de homogénea N- glicosilada proteína. Aquí, describimos la implantación de un vitro química enfoque que une moléculas de glucosa a los sitios de proteína específica aplicables para entender los efectos subyacentes del N- glycosylation en mecanismo y estructura de la proteína. Usando la espectroscopia de resonancia magnética nuclear solución evaluamos tanto eficacia de la modificación, así como las consecuencias estructurales de la fijación de glucosa con una sola muestra. Este enfoque puede ser adaptado fácilmente para estudiar las proteínas glycosylated múltiples encontradas en la naturaleza.

Introducción

Almacenar calcio operado (Ca^{2 +}) (SOCE) es la vía principal por la que las células inmunes toman Ca^{2 +} desde el espacio extracelular en el citosol. En los linfocitos T, receptores de células T localizados en la membrana plasmática (PM) unen los antígenos que activan proteínas quinasas de tirosina (revisadas en ^1,2,3). Una cascada de fosforilación conduce a la activación de fosfolipasa-γ (PLCγ) que posteriormente interviene en la hidrólisis de la membrana fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP₂) en diacilglicerol e inositol 1,4,5-trifosfato (IP....

Protocolo

1. reacción en cadena de polimerasa (polimerización en cadena)-mediada mutagénesis sitio-dirigida de la incorporación de Cys en un vector de expresión bacteriano pET-28a.

1. Determinar la concentración del vector pET-28a (es decir, doble trenzado DNA) utilizando un coeficiente de extinción (UV) ULTRAVIOLETA de 0.020 (μg/mL) cm ^-1 a 260 nm.
2. Sintetizar un par de primers mutagénicos complementarios para cada mutación de Cys tal que yo) hay un mínimo de 15 nucleótidos complementarios a la plantilla antes de la coincidencia de la primera base y 15 nucleótidos complementarios a la plantilla después de la discrepancia de base final, ....

Resultados

El primer paso de este enfoque requiere la mutagénesis de los residuos de glicosilación de candidato a residuos de Cys, que pueden ser modificables mediante la EFSAM de glucosa-5-MTS. tiene ningunos residuos Cys endógenos, por lo que no hay consideraciones especiales deben hacerse antes del mutagénesis. Sin embargo, residuos Cys nativos deben ser transformados a residuos no modificables antes de realizar la química describe. Para mínimamente la estructura nativa, sugerimos realizar una al.......

Discusión

Glycosylation de la proteína es una modificación post-translacional donde azúcares se unen covalentemente a polipéptidos principalmente a través de vínculos con las cadenas laterales del aminoácido. 50% de proteínas mamíferos son glicosiladas ⁵⁴, donde las proteínas glicosiladas posteriormente pueden tener una amplia gama de efectos de alterar la afinidad biomolecular, que influyen en la proteína plegable, alterando la actividad del canal, dirigido a moléculas de degradación y tráfico, por nombrar.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Phusion ADN polimerasa	Thermo Fisher Scientific	F530S	Uso en el paso 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific FERSM1163		Uso en el paso 1.6.
Enzima de restricción DpnI	New England Biolabs, Inc.	R0176	Uso en el paso 1.8.
Kit de mini plásmido Presto	GeneAid, Inc.	PDH300	Uso en el paso 1.16.
BL21 DE3 codón (+) E. coli	Agilent Technologies, Inc.	230280	Úselo en el paso 2.1.
DH5a E. coli	Invitrogen, Inc.	18265017	Úselo en el paso 1.9.
Filtro de jeringa de 0,22 mm	Millipore, Inc.	SLGV033RS	Úselo en el paso 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Resina de agarosa	Thermo Fisher Scientific	88221	Úselo en el paso 3.3.
Tubo de diálisis MWCO de 3.500 Da	BioDesign, Inc.	D306	Uso en los pasos 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 y 4.6.
Trombina bovina	BioPharm Laboratories, Inc.	SKU91-055	Úselo en el paso 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Columna de intercambio aniónico	GE Healthcare, Inc.	17-5156-01	Úselo en el paso 3.11.
Glucosa-5-MTS	Toronto Research Chemicals, Inc.	G441000	Úselo en el paso 4.1.
Concentradores centrífugos de ultrafiltración Vivaspin 20	Sartorius, Inc.	VS2001	Uso en los pasos 3.11, 4.2, 4.5 y 4.6.
PageRuler Escalera de proteínas anchas sin teñir	Thermo Fisher Scientific	26630	Uso en los pasos 3.7, 3.10 y 3.15
HiTrap Q FF Columna de intercambio aniónico	GE Healthcare, Inc.	17-5053-01	Úselo en el paso 3.12.
Sistema de cromatrografía líquida de proteína pura rápida AKTA	GE Healthcare, Inc.	29018224	Úselo en el paso 3.14.
Espectrómetro de RMN Varian Inova de 600 MHz	Agilent Technologies, Inc.		Úselo en los pasos 5.2 y 5.5.