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Immunology and Infection

Dirigida a tioles de la cisteína para in Vitro específica glicosilación de proteínas recombinantes

Published: October 04, 2017
doi:
10.3791/56302
, , , , ,
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry,University of Western Ontario

Summary

Análisis bioquímicos y estructurales de proteínas glicosiladas requieren cantidades relativamente grandes de muestras homogéneas. Aquí, presentamos un método químico eficiente para el glycosylation sitio-específico de proteínas recombinantes purificados de bacterias dirigiéndose a tioles reactivos de Cys.

Abstract

Interacción stromal molecule-1 (STIM1) es un tipo-yo proteína transmembrana localizado en el retículo endoplásmico (ER) y membranas del plasma (PM). ER-residente STIM1 regula la actividad de PM Orai1 canales en un proceso conocido como tienda de entrada operado de calcio (Ca2 +) que es el principal Ca2 + proceso de señalización que conduce a la respuesta inmune. STIM1 se somete poste-de translación N– glicosilación en dos sitios de Asn luminales en el Ca2 + detección del dominio de la molécula. Sin embargo, los bioquímicos, biofísicos, y efectos biológicos de la estructura de N– glicosilada STIM1 fueron mal entendidos hasta recientemente debido a una incapacidad para obtener rápidamente altos niveles de homogénea N– glicosilada proteína. Aquí, describimos la implantación de un vitro química enfoque que une moléculas de glucosa a los sitios de proteína específica aplicables para entender los efectos subyacentes del N– glycosylation en mecanismo y estructura de la proteína. Usando la espectroscopia de resonancia magnética nuclear solución evaluamos tanto eficacia de la modificación, así como las consecuencias estructurales de la fijación de glucosa con una sola muestra. Este enfoque puede ser adaptado fácilmente para estudiar las proteínas glycosylated múltiples encontradas en la naturaleza.

Introduction

Almacenar calcio operado (Ca2 +) (SOCE) es la vía principal por la que las células inmunes toman Ca2 + desde el espacio extracelular en el citosol. En los linfocitos T, receptores de células T localizados en la membrana plasmática (PM) unen los antígenos que activan proteínas quinasas de tirosina (revisadas en 1,2,3). Una cascada de fosforilación conduce a la activación de fosfolipasa-γ (PLCγ) que posteriormente interviene en la hidrólisis de la membrana fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2) en diacilglicerol e inositol 1,4,5-trifosfato (IP3 ). IP3 es un pequeño mensajero difusible que se une a la IP3 receptores (IP3R) en el retículo endoplásmico (ER) tal modo abriendo este canal del receptor y permitiendo Ca2 + fluyan abajo del gradiente de la concentración de la ER Lumen en el citosol (revisado en 4). Receptores acoplados a proteínas G y receptores de tirosina quinasa en una variedad de otros plomo de los tipos de células excitables y no excitables de señalización para la misma producción de IP3 y activación del IP3Rs.

Debido al finito Ca2 + capacidad de almacenamiento de la ER, la IP3-liberación mediada y el resultante aumento citosólico Ca2 + es sólo transitorio; sin embargo, este agotamiento del ER luminal Ca2 + efectos profundamente interacción stromal molecule-1 (STIM1), un tipo-yo transmembrana (TM) proteína que se encuentra sobre todo en el ER membrana 5,6,7. STIM1 contiene un lumen-orientado Ca2 + detección dominio formado por un par de EF-mano y estéril α-adorno (EFSAM). Tres dominios de en espiral-arrolle citosólica orientado se separan del EFSAM por el dominio TM (revisado en 8). Sobre ER luminal Ca2 + agotamiento, EFSAM sufre una Oligomerización de desestabilización junto 7,9 que causa los cambios estructurales de la TM y dominios coiled-coil 10. Estos cambios estructurales culminan en una captura de STIM1 en ER-PM las ensambladuras 11,12,13,14 a través de interacciones con PM fosfoinosítidos 15, 16 y Orai1 subunidades 17,18. Proteínas de Orai1 son las subunidades PM que montan en forma de Ca2 + canales21,de 19,20,22. Las interacciones STIM1 Orai1 en ER-PM ensambladuras facilitan una abierto Ca2 + desbloqueo activado Ca2 + (CRAC) canal conformación que permite el movimiento de Ca2 + en el citosol de las altas concentraciones de la espacio extracelular. En las células inmunes, el sostenido citosólica Ca2 + elevaciones vía CRAC inducen el Ca2 +– calmodulina/calcineurina dependiente desfosforilación del factor nuclear de células T activadas que posteriormente entra en el núcleo y comienza la regulación transcripcional de genes promoviendo la activación de células T 1,3. El proceso de activación de canal CRAC por STIM1 23,24 vía inducida por el agonista ER luminal Ca2 + agotamiento y la Ca2 + elevación citosólica sostenida resultante se denomina colectivamente SOCE 25. El papel vital de la SOCE en células de T es evidente por estudios que demuestran que las mutaciones heredables en STIM1 y Orai1 pueden causar inmunodeficiencia combinada severa síndromes 3,19,26, 27. EFSAM inicia SOCE después de detección luminal ER Ca2 + agotamiento de la vía la pérdida de Ca2 + coordinación de la mano de EF canónica, en última instancia conduciendo a la desestabilización junto autoasociación 7, 28,29.

Glicosilación es el accesorio covalente y procesamiento de estructuras de oligosacáridos, también conocido como glycans, a través de varios pasos biosintéticos en el ER y Golgi (revisado en 30,32,33). Hay dos tipos predominantes de glicosilación en eucariotas: N-ligados y O-ligado, según el aminoácido específico y el átomo tiende un puente sobre el acoplamiento. En la N– glicosilación, glicanos se unen a la amida de la cadena de lado de Asn, y en la mayoría de los casos, el paso de iniciación ocurre en el retículo endoplasmático como el polipéptido cadena se mueve en la luz 34. El primer paso de la N– glicosilación es la transferencia de una estructura de base 14-azúcar compuesta por glucosa (Glc), manosa (hombre) y N– acetilglucosamina (GlcNAc) (es decir, Glc3hombre9GlcNAc2) de una ER lípidos de membrana por un oligosaccharyltransferase 35,36. Otras medidas, como el escote o la transferencia de residuos de glucosa, son catalizadas en ER por glicosiltransferasas y glicosidasas específicas. Algunas proteínas que las ER y en el Golgi pueden ser otros procesados 37. O– glicosilación se refiere a la adición de glycans, generalmente para el grupo de hidroxilo de cadena lateral de residuos de Ser o Thr, y esta modificación ocurre enteramente en el complejo de Golgi 33,34. Hay varios O– glicanos las estructuras que pueden hacerse de N– acetilglucosamina fucosa, galactosa y ácido siálico con cada monosacárido añadido secuencialmente 33.

Mientras que ninguna secuencia específica se ha identificado como prerrequisito para muchos tipos de O– glicosilación, una secuencia consenso común se ha asociado con la N-ligado modificación: Asn-X-Ser/Thr/Cys, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro 33. EFSAM STIM1 contiene dos de estos sitios de consenso de N– glicosilación: Asn131-Trp132-Thr133 y Asn171-Thr172-Thr173. De hecho, estudios previos han demostrado que la EFSAM puede ser N– glicosilada en células de mamífero en Asn131 y Asn171 38,39,40,41. Sin embargo, estudios previos de las consecuencias de la N– glicosilación en SOCE han sido incongruentes, sugiriendo suprimido, potenciada o no efecto por esta modificación poste-de translación en SOCE activación 38,= “xref” > 39,40,41. Así, la investigación sobre las consecuencias biofísicas, bioquímicas y estructurales subyacentes de EFSAM N– glicosilación es vital para comprender los efectos regulatorios de esta modificación. Debido a la exigencia de altos niveles de proteínas homogéneas en estos experimentos en vitro , se aplicó un enfoque selectivo de sitio para unir covalentemente moléculas de glucosa a EFSAM. Curiosamente, glicosilación Asn131 y Asn171 había causado cambios estructurales que convergen dentro de la base EFSAM y mejoran las propiedades biofísicas que promueven la SOCE STIM1 mediada por 42.

La fijación química de glycosyl grupos al Cys tioles ha sido bien establecida por un trabajo que demostró por primera vez la utilidad de este enfoque de enzima libre para entender los efectos específicos del sitio de glicosilación en función de la proteína 43 , 44. más recientemente y con respecto a STIM1, los residuos Asn131 y Asn171 fueron transformados a Cys y glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] fue utilizado a covalente enlace glucosa a los tioles libres 42. Aquí, describimos este enfoque que no sólo utiliza la mutagénesis para incorporar residuos de Cys específicos del sitio para la modificación, pero también se aplica la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) de solución para rápidamente evaluar eficacia de modificación y estructural perturbaciones como consecuencia de la glicosilación. En particular, esta metodología general es fácilmente adaptable para estudiar los efectos de cualquiera de los dos O– o N– glicosilación de cualquiera producido por vía recombinante proteína.

Protocol

1. reacción en cadena de polimerasa (polimerización en cadena)-mediada mutagénesis sitio-dirigida de la incorporación de Cys en un vector de expresión bacteriano pET-28a. Determinar la concentración del vector pET-28a (es decir, doble trenzado DNA) utilizando un coeficiente de extinción (UV) ULTRAVIOLETA de 0.020 (μg/mL) cm -1 a 260 nm. Sintetizar un par de primers mutagénicos complementarios para cada mutación de Cys tal que yo) hay un mínimo de 15 nucleótidos complem…

Representative Results

El primer paso de este enfoque requiere la mutagénesis de los residuos de glicosilación de candidato a residuos de Cys, que pueden ser modificables mediante la EFSAM de glucosa-5-MTS. tiene ningunos residuos Cys endógenos, por lo que no hay consideraciones especiales deben hacerse antes del mutagénesis. Sin embargo, residuos Cys nativos deben ser transformados a residuos no modificables antes de realizar la química describe. Para mínimamente la estructura nativa, sugerimos realizar …

Discussion

Glycosylation de la proteína es una modificación post-translacional donde azúcares se unen covalentemente a polipéptidos principalmente a través de vínculos con las cadenas laterales del aminoácido. 50% de proteínas mamíferos son glicosiladas 54, donde las proteínas glicosiladas posteriormente pueden tener una amplia gama de efectos de alterar la afinidad biomolecular, que influyen en la proteína plegable, alterando la actividad del canal, dirigido a moléculas de degradación y tráfic…

Acknowledgements

Esta investigación fue apoyada por las ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá (05239 a P.B.S.), Fundación Canadiense para la investigación del fondo de innovación/Ontario (a P.B.S.), Fundación lucha contra el de próstata cáncer – Telus Ride para papá (P.B.S.) y Ontario Beca de postgrado (para Y.J.C. y N.S.).

Materials

Phusion DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530S Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific FERSM1163 Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme New England Biolabs, Inc. R0176 Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit GeneAid, Inc. PDH300 Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli Agilent Technologies, Inc. 230280 Use in step 2.1.
DH5a E. coli Invitrogen, Inc. 18265017 Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter Millipore, Inc. SLGV033RS Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin Thermo Fisher Scientific 88221 Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing BioDesign, Inc. D306 Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin BioPharm Laboratories, Inc. SKU91-055 Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5156-01 Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS Toronto Research Chemicals, Inc. G441000 Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators Sartorius, Inc. VS2001 Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26630 Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5053-01 Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System GE Healthcare, Inc. 29018224 Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer Agilent Technologies, Inc. Use in step 5.2 and 5.5.
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Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S., Siddiqui, N., Feng, Q., Stathopulos, P. B. Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. (128), e56302, doi:10.3791/56302 (2017).
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