재조합 형 단백질의 생체 외에서 사이트별 Glycosylation에 대 한 대상 시스테인 Thiols
Summary
당화 단백질의 생화학 및 구조 분석 균질 샘플 상대적으로 많은 양의 필요합니다. 여기, 우리는 효율적인 화학 반응 Cys thiols를 대상으로 박테리아에서 정화 하는 재조합 형 단백질의 사이트별 glycosylation 방법 제시.
Abstract
Stromal 상호 작용 분자-1 (STIM1)은-내가 막 횡단 단백질 바인딩과 그물 (ER) 및 플라즈마 막 (오후)에 위치 해 있습니다. ER-상주 STIM1 오후 Orai1 채널 알려져 주 캘리포니아2 + 신호 과정 면역 응답을 구동 하는 운영된 칼슘 (캘리포니아2 +) 항목을 저장 하는 과정에서의 활동을 통제 한다. STIM1 Ca2 + 감지의 도메인 내에서 분자 두 luminal Asn 사이트에 닢 Nglycosylation를 겪 습. 그러나,는 생화학, 생물, 그리고 N-당화 STIM1의 구조 생물학적 효과 쉽게 균질 N-당화 단백질의 높은 수준을 얻을 수 없음 인해 최근까지 제대로 이해 했다. 여기, 우리가 시험관에 화학 접근의 단백질 구조와 메커니즘에 Nglycosylation의 기본 효과 이해 하는 데 적용 하는 특정 단백질 사이트로 포도 moieties 부착 구현을 설명 합니다. 우리 모두 효율성의 수정 뿐만 아니라 단일 샘플 포도 당 첨부 파일의 구조 결과 평가 솔루션 핵 자기 공명 분광학을 사용 하 여. 이 이렇게 자연에서 발견 하는 무수 한 당화 단백질 연구를 쉽게 적응 수 있습니다.
Introduction
운영된 칼슘 (캘리포니아2 +) 저장 항목 (SOCE)는 면역 세포는 cytosol로 세포 외 공간에서 캘리포니아2 + 을 차지 하는 주요 통로 이다. T 세포, T 세포 수용 체 (오후) 원형질 막에 있는 항 원 단백질 tyrosine kinases ( 1,2,3검토)을 활성화 하는 바인딩합니다. 인 산화 폭포 phospholipase-γ (PLCγ)는 이후 diacylglycerol 및 이노 시 톨 1,4,5-trisphosphate (IP3에 막 phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (핍2)의 가수분해를 중재의 활성화로 연결 ). IP3 은 응급실에서 농도 기온 변화도 아래로 흐름 IP3 수용 체 (IP3R) 바인딩과 그물 (ER)에 그로 인하여이 수용 체 수로 열고 허용 캘리포니아2 + 바인딩하는 작은 diffusible 메신저 cytosol ( 4에서검토)에 루멘. 수용 체 G 단백질 결합 및 다양 한 기타 고르기 및 비 고르기 셀 유형 리드에에서 티로신 키 니 아 제 수용 체에서 IP3 의 동일한 생산 및 IP3Rs의 활성화 신호.
유한 캘리포니아2 + 의 저장 용량은 응급실, IP3인-중재 릴리스 및 cytosolic 캘리포니아2 + 에서 결과 증가 일시적;만 그러나, 응급실 luminal 캘리포니아2 + 이 고갈 뿌리깊은 stromal 상호 작용 분자-1 (STIM1), 유형 효과-난 막 횡단 (TM) 단백질은 주로 응급실 막 5,,67에 발견. STIM1 루멘 지향 Ca2 + 감지 도메인을 EF-손 쌍과 마른 α-주제 (EFSAM) 구성 포함 되어 있습니다. Cytosolic 지향 코일 코일 도메인 3 개 ( 8에서 검토) 단일 TM 도메인에서 EFSAM에서 분리 된다. ER luminal 캘리포니아2 + 고갈, 시 EFSAM TM 및 코일 코일 도메인 10의 구조상 재배열을 일으키는 원인이 되는 불안정 결합 oligomerization 7,9 을 겪 습. 이러한 구조 변화 응급실 오후 접속점 11,12,13,14 오후 phosphoinositides 15, 와 상호 작용을 통해 STIM1의 트랩에 달 하다 16 및 Orai1 소 단위 17,18. Orai1 단백질은 조립 형태로 캘리포니아2 + 채널 19,20,,2122는 오후 소 단위. ER-오후 접합에서 STIM1 Orai1 상호 작용 촉진는 오픈 캘리포니아2 + 릴리스 활성화 캘리포니아2 + (CRAC) 채널 구조의 높은 농도에서 cytosol에 캘리포니아2 + 의 움직임을 가능 하 게 합니다 세포 외 공간입니다. 면역 세포에는 지속적인된 cytosolic 캘리포니아2 + 고도 CRAC 채널을 통해 유도 캘리포니아2 +-calmodulin/calcineurin 종속 dephosphorylation 이후 핵을 입력 하면 활성화 된 T-세포의 핵 요인의 고 T 세포 활성화 1,3를 홍보 하는 유전자의 transcriptional 규칙을 시작 합니다. STIM1 23,24 주 작동 근 유도 응급실 luminal 캘리포니아2 + 고갈 통해 결과 지속적인된 cytosolic 캘리포니아2 + 고도로 CRAC 채널 활성화의 과정은 공동으로 SOCE 25불린다. T-세포에 SOCE의 중요 한 역할은 STIM1와 Orai1에서 상속 변이 심한 결합 된 면역 결핍 증후군 3,,1926, 를 발생할 수 있습니다 입증 하는 연구에 의해 분명 하다 27. 정식 EF-손에서 궁극적으로 자체 협회 불안 결합 7, 로 이어지는 Ca2 + 조정의 손실을 통해 응급실 luminal 캘리포니아2 + 고갈 감지 후 SOCE를 시작 하는 EFSAM 28,29.
Glycosylation 공유 첨부 파일 올리고 당 구조, 일컬어 glycans, ER 및 Golgi ( 30,,3233검토) 다양 한 생 합성 단계를 통해의 처리입니다. 진핵생물에서 glycosylation의 두 가지 주된 유형이 있다: N-연결 된 및 O-연결, 특정 아미노산 및 atom 가교 결합에 따라. N-glycosylation에서 glycans, Asn의 사이드 체인 아 미드에 연결 그리고 개시 단계 응급실에서 발생 하는 대부분의 경우에는 polypeptide 사슬 루멘 34로 이동. N-glycosylation의 첫 번째 단계는 포도 당 (Glc)만 노 오 스 (남자), 및 N-acetylglucosamine (GlcNAc) (예: Glc3남자9GlcNAc2)는 ER에서 만들어진 14 설탕 코어 구조 이전 oligosaccharyltransferase 35,36여 막 지질. 분열 또는 포도 당 잔류물의 양도 등의 더 단계는 특정 glycosidases와 glycosyltransferases 응급실에서 촉매. 응급실을 두고는 골으로 이동 하는 일부 단백질은 처리 37추가 될 수 있습니다. Oglycosylation Ser 또는 Thr 잔류물의 사이드 체인 수 산 기 그룹에 일반적으로 glycans의 추가를 참조 하 고이 수정 골 복잡 한 33,34에서 전적으로 발생 합니다. Nacetylglucosamine, fucose, 갈 락 토스, 구성 될 수 있는 여러 오-glycan 구조 이며 각 단 당 류와 sialic acid 33순차적으로 추가.
아니 특정 순서 Oglycosylation의 많은 종류에 대 한 사전 요구 사항 확인 되었습니다 동안 일반적인 합의 순서 N와 연결 되었습니다-수정 연결: Asn-X-Ser/Thr/Cys, X 어떤 아미노산을 될 수 있는 프로 33제외 하 고. STIM1 EFSAM 두 이러한 합의 N-glycosylation 사이트 포함: Asn131-Trp132-Thr133와 Asn171-Thr172-Thr173. 실제로, 이전 연구 EFSAM Asn131 및 Asn171 38,39,,4041에서 포유류 세포에서 N-당화 수 나타났습니다. 그러나, 이전 연구의 SOCE에서 Nglycosylation의 결과 되었다 합동, 제안 억제, potentiated 또는 SOCE 활성화 38, 에이 포스트 번역 상 수정에 의해 영향을 주지 않습니다“외부 참조” = > 39,,4041. 따라서, EFSAM Nglycosylation의 기본, 생화학, 생물 및 구조 결과 대 한 연구는이 수정의 규제 효과 이해 하는 중요 한. 이러한 생체 외에서 실험에 균질 단백질의 높은 수준에 대 한 요구 사항으로 인해 포도 당 moieties EFSAM covalently 연결할 사이트 선택적 접근 방식을 적용 했다. 흥미롭게도, Asn131 및 Asn171 glycosylation EFSAM 코어 내 수렴을 홍보 STIM1이 중재 SOCE 42생물 속성 강화 구조 변경 발생 합니다.
Cys thiols glycosyl 그룹의 화학 첨부 파일 정액 작품 처음 시연 단백질 기능 43 , glycosylation의 사이트 효과 이해 하 고이 효소 무료로 접근의 유틸리티에 의해 잘 설립 되었습니다. , 44. 최근에 STIM1에 관하여 Asn131과 Asn171 잔류물 했다 Cys을 돌연변이 glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] covalently 무료 thiols 42에 포도 당을 연결 하는 데 사용 되었다. 여기, 우리 뿐만 아니라 mutagenesis 통합 수정에 대 한 사이트 특정 Cys의 잔류물을 사용 하지만 빠르게 수정 효율성 및 구조적 평가 솔루션 핵 자기 공명 (NMR) 분광학은 또한 적용 됩니다이 이렇게 설명 섭은 glycosylation 결과로입니다. 특히,이 일반적인 방법론 중 O-의 효과 연구에 쉽게 적응 또는 N-glycosylation의 recombinantly 단백질을 생산.
Protocol
Representative Results
Discussion
단백질 glycosylation 설탕 covalently 주로 아미노산 사이드 체인 관계를 통해 polypeptides에 연결 된 포스트 번역 상 수정입니다. 많은 포유류 단백질의 50%는 당화 54, 당화 단백질 수 이후에 있는 다양 한 바이오 바인딩 선호도 변경에서 효과, 단백질 폴딩, 채널 활동을 변경, 대상에 영향을 미치는 저하 및 셀룰러 (33에서 검토 한 결과) 몇 가지 이름을, 인신 매매에 대 한…
Acknowledgements
이 연구는 자연과학 및 공학 연구 위원회 캐나다의 (P.B.S.에 05239), 캐나다 재단에 의해 지원 되었다 혁신/온타리오 연구 기금 (P.B.S.), 전립선 암 싸 워 재단-Telus 타고 아빠 (P.B.S.) 하 고 온타리오에 대 한 (Y.J.C. N.S.)를 대학원 장학입니다.
Materials
| Phusion DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | Use in step 1.3. |
| Generuler 1kb DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1163 | Use in step 1.6. |
| DpnI Restriction Enzyme | New England Biolabs, Inc. | R0176 | Use in step 1.8. |
| Presto Mini Plasmid Kit | GeneAid, Inc. | PDH300 | Use in step 1.16. |
| BL21 DE3 codon (+) E. coli | Agilent Technologies, Inc. | 230280 | Use in step 2.1. |
| DH5a E. coli | Invitrogen, Inc. | 18265017 | Use in step 1.9. |
| 0.22 mm Syringe Filter | Millipore, Inc. | SLGV033RS | Use in step 2.3. |
| HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin | Thermo Fisher Scientific | 88221 | Use in step 3.3. |
| 3,500 Da MWCO Dialysis Tubing | BioDesign, Inc. | D306 | Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6. |
| Bovine Thrombin | BioPharm Laboratories, Inc. | SKU91-055 | Use in step 3.9. |
| 5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column | GE Healthcare, Inc. | 17-5156-01 | Use in step 3.11. |
| Glucose-5-MTS | Toronto Research Chemicals, Inc. | G441000 | Use in step 4.1. |
| Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators | Sartorius, Inc. | VS2001 | Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6. |
| PageRuler Unstained Broad Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26630 | Use in step 3.7, 3.10 and 3.15 |
| HiTrap Q FF Anion Exchange Column | GE Healthcare, Inc. | 17-5053-01 | Use in step 3.12. |
| AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System | GE Healthcare, Inc. | 29018224 | Use in step 3.14. |
| 600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | Use in step 5.2 and 5.5. |
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