Целеуказание тиолы цистеина в Vitro участкам гликозилирования рекомбинантных белков
Summary
Анализ биохимических и структурных белков гликозилированного требуют относительно большое количество однородных образцов. Здесь мы представляем эффективный метод химического для конкретных участков гликозилирования рекомбинантных белков, очищенного от бактерий путем ориентации реактивной Cys тиолы.
Abstract
Стромальные взаимодействия молекулы-1 (STIM1) — это тип-я белка трансмембранного расположен на эндоплазменный ретикулум (ER) и мембраны плазмы (PM). ER-житель STIM1 регулирует деятельность вечера Orai1 каналов в процесс, известный как хранить оперированных кальция (Ca2 +) запись, которая является главным Ca2 + сигнализации процесс, который управляет иммунного ответа. STIM1 проходит столб-поступательные N– гликозилирования на двух участках Люминал Asn в Ca2 + зондирования домена молекулы. Однако биохимических, биофизических, и структуру биологических эффектов N– гликозилированного STIM1 были плохо поняты до недавно из-за неспособности легко получить высокий уровень однородных N– гликозилированного белка. Здесь мы описываем осуществление в vitro химический подход, который придает глюкозы постановление определенных белков сайтов применимым к пониманию основной воздействия N– гликозилирования на механизм и структуры белков. С помощью решения ЯМР спектроскопии мы оценивать как эффективность модификации, а также структурные последствия глюкозы вложения с одного образца. Этот подход может быть легко адаптирована к изучения множества гликозилированного белков, обнаруженных в природе.
Introduction
Хранить оперированных кальция (Ca2 +) вход (SOCE) является основным путь, по которому иммунные клетки take up Ca2 + от внеклеточного пространства в цитозоль. В Т-лимфоцитов Т-клеток рецепторов, расположенных на мембране плазмы (PM) связывать антигены, которые активируют белка тирозин киназ (обзор в 1,2,3). Фосфорилирование Каскад приводит к активации фосфолипазы γ (PLCγ), который впоследствии опосредует гидролиза мембраны фосфатидилинозитол 4,5-Бисфосфат (пункт2) в диацилглицерол и инозитол 1,4,5-trisphosphate (IP3 ). IP3 является небольшой diffusible messenger, который привязывается к IP3 рецепторов (IP3R) в эндоплазматический ретикулум (ER) тем самым открыв этот рецептор канал и разрешительные Ca2 + течь вниз градиент концентрации от ER просвет в цитозоле (обзор в 4). Рецептор сигнализации от G-белка в сочетании и тирозин киназы рецепторов в различных других типов свинца возбудимых и не возбудимых клеток же производства IP3 и активации IP3Rs.
Из-за ограниченных Ca2 + емкость ER, IP3-опосредованной выпуска и результирующая увеличение цитозольной Ca2 + только является несохраняемым; Однако, это истощение ER Люминал Ca2 + глубоко эффекты стромальные взаимодействия молекулы-1 (STIM1), тип-я трансмембранного (TM) белков чаще встречаются на ER мембраны 5,6,7. STIM1 содержит люмен ориентированный Ca2 + зондирования домен состоит из пары EF-рука и стерильные α-мотив (EFSAM). Три ориентированных на цитозольной биспиральных домены отделены от EFSAM одного домена ТМ (обзор в 8). После ER Люминал Ca2 + истощение EFSAM подвергается дестабилизации в сочетании олигомеризации 7,9 , который вызывает структурных перестроек ТМ и домены биспиральных 10. Эти структурные изменения кульминацией треппинга STIM1 ER-PM развязок 11,12,13,14 через взаимодействие с вечера фосфоинозитидов 15, 16 и Orai1 субблоков 17,18. Orai1 белки являются субблоков вечера, которые собираются форме Ca2 + каналы 19,20,21,22. STIM1-Orai1 взаимодействий на перекрестках ER-PM содействовать открытой Ca2 + релиз активирован Ca2 + (CRAC) канал конформации который позволяет движение Ca2 + в цитозоль от высоких концентраций внеклеточного пространства. В иммунных клеток, устойчивый цитозольной Ca2 + фасады каналам Крак побудить Ca2 +– Кальмодулин/кальциневрина зависимых дефосфорилирование ядерного фактора активированные Т-клеток, который впоследствии проникает в ядро и начинает регуляцию генов, поощрение Т-клеток активации 1,3. Процесс активации Крак канал STIM1 23,24 через агонист индуцированной ER Люминал Ca2 + истощения и результате устойчивой цитозольной Ca2 + высота собирательно именуются SOCE 25. Жизненно важную роль SOCE в Т-клеток проявляется исследования демонстрируют, что наследственные мутации в STIM1 и Orai1 может вызвать тяжелый комбинированный иммунодефицит синдромы 3,19,26, 27. EFSAM инициирует SOCE после зондирования ER-просветный Ca2 + истощение через потери Ca2 + координации на канонической EF-рука, в конечном счете приводит к дестабилизации в сочетании самостоятельной ассоциации 7, 28,29.
Гликозилирование является ковалентной привязанность и обработка олигосахарида структур, также известный как гликаны, через различные биосинтетических шаги в ER и Гольджи (обзор в 30,,32–33). Существует два преобладающего типа гликозилирования у эукариот: N-связанные и O-связаны, в зависимости от конкретных amino acid и преодоление связь атома. В N– гликозилирования, гликанов прикрепляются к боковой цепи Амида в АСЦ, и в большинстве случаев, шаг возбуждение возникает в ER как полипептидной цепи перемещается в Люмене 34. На первом шаге N– гликозилирования является передача четырнадцать сахара ядра структура, состоящая из глюкозы (КЗС), манноза (Man) и N– acetylglucosamine (GlcNAc) (т.е. Glc3человек9GlcNAc2) от ER мембранных липидов, 35,oligosaccharyltransferase36. Дальнейшие шаги, такие, как расщепление или передаче остатков глюкозы, в ER катализируемые конкретную основу и гликозидазы. Некоторые белки, которые оставляют ER и переехать в Гольджи можно дополнительно обработанных 37. O– гликозилирования относится с добавлением гликаны, обычно в боковой цепи гидроксильной группы Ser или чет остатков, и это изменение происходит полностью в комплекс Гольджи 33,34. Существует несколько O– glycan структур, которые могут быть сделаны N– acetylglucosamine, Фукоза, галактоза, и сиаловая кислота с каждым моносахаридов последовательно добавлены 33.
Хотя без конкретных последовательность была определена в качестве предпосылки для многих типов O– гликозилирования, общую последовательность консенсуса был связан с N-связанных изменений: Asn-X-Ser/Чет/КМС, где X может быть любой амино кислоты за исключением Pro 33. STIM1 EFSAM содержит два из этих консенсуса N– гликозилирования сайтов: Asn131-Trp132-Thr133 и Asn171-Thr172-Thr173. Действительно предыдущие исследования показали, что EFSAM может быть N– гликозилированного в клетках млекопитающих в Asn131 и Asn171, 3839,40,41. Однако, предыдущие исследования последствий N– гликозилирования на SOCE были несовместимы, предлагая подавлены, потенцированные или не влияет на этот столб-поступательные изменения на SOCE активации 38,= «внешней» > 3940,,41. Таким образом исследования на основные биофизические, биохимические и структурные последствия EFSAM N– гликозилирования жизненно важное значение для понимания нормативных последствий этой модификации. Из-за требования для высоких уровней однородных белков в этих экспериментах в пробирке сайт селективный подход к ковалентно придают глюкоза постановление EFSAM был применен. Интересно, что Asn131 и Asn171 гликозилирования вызвало структурные изменения, которые сходятся в пределах EFSAM ядро и усиливают биофизические свойства, способствующие STIM1-опосредованной SOCE 42.
Химическая приверженность glycosyl групп Cys тиолы был хорошо установленными плодотворную работу, которая впервые продемонстрировал полезность этого фермента свободный подход к пониманию участкам воздействия гликозилирования на функции белка 43 , 44. совсем недавно и в отношении STIM1, остатки Asn131 и Asn171 были мутировал Cys и glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] была использована для ковалентно связать бесплатно тиолы 42глюкозы. Здесь мы опишем этот подход, который не только использует для включения конкретных остатки Cys сайт для модификации мутагенеза, но также применяется решение ядерного магнитного резонанса (ЯМР) спектроскопия быстро оценить изменения эффективности и структурной возмущений в результате гликозилирования. Особенно эта общая методология легко адаптируется для изучения последствий либо O– или N– гликозилирования любого recombinantly производства белка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Гликозилирование белков является столб-поступательные изменения где сахара ковалентно присоединены к полипептидов, главным образом благодаря наличию связей с боковых цепей аминокислот. Как много как 50% млекопитающих белков являются гликозилированного 54, где гликозилир?…
Acknowledgements
Это исследование было поддержано естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (05239 P.B.S.), Канадский фонд для инноваций/Онтарио научный фонд (для P.B.S.), рака простаты бороться фонд – Telus Ride для папы (для P.B.S.) и Онтарио Магистратура стипендии (для Y.J.C. и н.с.).
Materials
| Phusion DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | Use in step 1.3. |
| Generuler 1kb DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1163 | Use in step 1.6. |
| DpnI Restriction Enzyme | New England Biolabs, Inc. | R0176 | Use in step 1.8. |
| Presto Mini Plasmid Kit | GeneAid, Inc. | PDH300 | Use in step 1.16. |
| BL21 DE3 codon (+) E. coli | Agilent Technologies, Inc. | 230280 | Use in step 2.1. |
| DH5a E. coli | Invitrogen, Inc. | 18265017 | Use in step 1.9. |
| 0.22 mm Syringe Filter | Millipore, Inc. | SLGV033RS | Use in step 2.3. |
| HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin | Thermo Fisher Scientific | 88221 | Use in step 3.3. |
| 3,500 Da MWCO Dialysis Tubing | BioDesign, Inc. | D306 | Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6. |
| Bovine Thrombin | BioPharm Laboratories, Inc. | SKU91-055 | Use in step 3.9. |
| 5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column | GE Healthcare, Inc. | 17-5156-01 | Use in step 3.11. |
| Glucose-5-MTS | Toronto Research Chemicals, Inc. | G441000 | Use in step 4.1. |
| Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators | Sartorius, Inc. | VS2001 | Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6. |
| PageRuler Unstained Broad Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26630 | Use in step 3.7, 3.10 and 3.15 |
| HiTrap Q FF Anion Exchange Column | GE Healthcare, Inc. | 17-5053-01 | Use in step 3.12. |
| AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System | GE Healthcare, Inc. | 29018224 | Use in step 3.14. |
| 600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | Use in step 5.2 and 5.5. |
References
- Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).
- Feske, S., Skolnik, E. Y., Prakriya, M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 12 (7), 532-547 (2012).
- Shaw, P. J., Feske, S. Physiological and pathophysiological functions of SOCE in the immune system. Front Biosci (Elite Ed). 4, 2253-2268 (2012).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural aspects of calcium-release activated calcium channel function. Channels (Austin). 7 (5), 344-353 (2013).
- Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structure and function of endoplasmic reticulum STIM calcium sensors. Curr Top Membr. 71, 59-93 (2013).
- Stathopulos, P. B., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ames, J. B., Ikura, M. Stored Ca2+ depletion-induced oligomerization of stromal interaction molecule 1 (STIM1) via the EF-SAM region: An initiation mechanism for capacitive Ca2+ entry. J Biol Chem. 281 (47), 35855-35862 (2006).
- Stathopulos, P. B., Ikura, M. Store operated calcium entry: From concept to structural mechanisms. Cell Calcium. , (2016).
- Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structurally delineating stromal interaction molecules as the endoplasmic reticulum calcium sensors and regulators of calcium release-activated calcium entry. Immunol Rev. 231 (1), 113-131 (2009).
- Muik, M., et al. STIM1 couples to ORAI1 via an intramolecular transition into an extended conformation. EMBO J. 30 (9), 1678-1689 (2011).
- Luik, R. M., Wang, B., Prakriya, M., Wu, M. M., Lewis, R. S. Oligomerization of STIM1 couples ER calcium depletion to CRAC channel activation. Nature. 454 (7203), 538-542 (2008).
- Luik, R. M., Wu, M. M., Buchanan, J., Lewis, R. S. The elementary unit of store-operated Ca2+ entry: local activation of CRAC channels by STIM1 at ER-plasma membrane junctions. J Cell Biol. 174 (6), 815-825 (2006).
- Wu, M. M., Buchanan, J., Luik, R. M., Lewis, R. S. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol. 174 (6), 803-813 (2006).
- Liou, J., Fivaz, M., Inoue, T., Meyer, T. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+ store depletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9301-9306 (2007).
- Calloway, N., et al. Stimulated association of STIM1 and Orai1 is regulated by the balance of PtdIns(4,5)P(2) between distinct membrane pools. J Cell Sci. 124 (Pt 15), 2602-2610 (2011).
- Korzeniowski, M. K., et al. Dependence of STIM1/Orai1-mediated calcium entry on plasma membrane phosphoinositides. J Biol Chem. 284 (31), 21027-21035 (2009).
- Park, C. Y., et al. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. Cell. 136 (5), 876-890 (2009).
- Yuan, J. P., et al. SOAR and the polybasic STIM1 domains gate and regulate Orai channels. Nat Cell Biol. 11 (3), 337-343 (2009).
- Feske, S., et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature. 441 (7090), 179-185 (2006).
- Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
- Vig, M., et al. CRACM1 multimers form the ion-selective pore of the CRAC channel. Curr Biol. 16 (20), 2073-2079 (2006).
- Vig, M., et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Science. 312 (5777), 1220-1223 (2006).
- Liou, J., et al. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Curr Biol. 15 (13), 1235-1241 (2005).
- Roos, J., et al. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol. 169 (3), 435-445 (2005).
- Putney, J. W. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium. 7 (1), 1-12 (1986).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. 460 (2), 417-435 (2010).
- Maus, M., et al. Missense mutation in immunodeficient patients shows the multifunctional roles of coiled-coil domain 3 (CC3) in STIM1 activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6206-6211 (2015).
- Stathopulos, P. B., Zheng, L., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ikura, M. Structural and mechanistic insights into STIM1-mediated initiation of store-operated calcium entry. Cell. 135 (1), 110-122 (2008).
- Stathopulos, P. B., Ikura, M. Partial unfolding and oligomerization of stromal interaction molecules as an initiation mechanism of store operated calcium entry. Biochem Cell Biol. 88 (2), 175-183 (2010).
- Dennis, J. W., Lau, K. S., Demetriou, M., Nabi, I. R. Adaptive regulation at the cell surface by N-glycosylation. Traffic. 10 (11), 1569-1578 (2009).
- Nilsson, T., Au, C. E., Bergeron, J. J. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi apparatus. FEBS Lett. 583 (23), 3764-3769 (2009).
- Stanley, P. Golgi glycosylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (4), (2011).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Gerlach, J., Sharma, S., Leister, K., Joshi, L., Agostinis, P., Afshin, S. . Endoplasmic Reticulum Stress in Health and Disease. , 23-39 (2012).
- Pearse, B. R., Hebert, D. N. Lectin chaperones help direct the maturation of glycoproteins in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 684-693 (2010).
- Stanley, P., Sundaram, S. Rapid assays for lectin toxicity and binding changes that reflect altered glycosylation in mammalian cells. Curr Protoc Chem Biol. 6 (2), 117-133 (2014).
- Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
- Csutora, P., et al. Novel role for STIM1 as a trigger for calcium influx factor production. J Biol Chem. 283 (21), 14524-14531 (2008).
- Kilch, T., et al. Mutations of the Ca2+-sensing stromal interaction molecule STIM1 regulate Ca2+ influx by altered oligomerization of STIM1 and by destabilization of the Ca2+ channel Orai1. J Biol Chem. 288 (3), 1653-1664 (2013).
- Williams, R. T., et al. Stromal interaction molecule 1 (STIM1), a transmembrane protein with growth suppressor activity, contains an extracellular SAM domain modified by N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta. 1596 (1), 131-137 (2002).
- Mignen, O., Thompson, J. L., Shuttleworth, T. J. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. 579 (Pt 3), 703-715 (2007).
- Choi, Y. J., Zhao, Y., Bhattacharya, M., Stathopulos, P. B. Structural perturbations induced by Asn131 and Asn171 glycosylation converge within the EFSAM core and enhance stromal interaction molecule-1 mediated store operated calcium entry. Biochim Biophys Acta. 1864 (6), 1054-1063 (2017).
- Davis, B. G., Lloyd, R. C., Jones, J. B. Controlled site-selective protein glycosylation for precise glycan structure-catalytic activity relationships. Bioorg Med Chem. 8 (7), 1527-1535 (2000).
- Gamblin, D. P., van Kasteren, S. I., Chalker, J. M., Davis, B. G. Chemical approaches to mapping the function of post-translational modifications. FEBS J. 275 (9), 1949-1959 (2008).
- Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Methods Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Bell, D. J. Mass spectrometry. Methods Mol Biol. 244, 447-454 (2004).
- Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
- Farrow, N. A., et al. Backbone Dynamics of a Free and a Phosphopeptide-Complexed Src Homology-2 Domain Studied by N-15 Nmr Relaxation. Biochemistry. 33 (19), 5984-6003 (1994).
- Kay, L. E., Keifer, P., Saarinen, T. Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity. Journal of the American Chemical Society. 114 (26), 10663-10665 (1992).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Masse, J. E., Keller, R. AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic. J Magn Reson. 174 (1), 133-151 (2005).
- Monticelli, M., Ferro, T., Jaeken, J., Dos Reis Ferreira, V., Videira, P. A. Immunological aspects of congenital disorders of glycosylation (CDG): a review. J Inherit Metab Dis. 39 (6), 765-780 (2016).
- An, H. J., Kronewitter, S. R., de Leoz, M. L., Lebrilla, C. B. Glycomics and disease markers. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 601-607 (2009).
- Wani, W. Y., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V., McMahon, L. L., Zhang, J. O-GlcNAcylation and neurodegeneration. Brain Res Bull. , (2016).
- Haines, A. M., Tobe, S. S., Kobus, H. J., Linacre, A. Properties of nucleic acid staining dyes used in gel electrophoresis. Electrophoresis. 36 (6), 941-944 (2015).
