JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

Målretting cystein Thiols for in Vitro områdespesifikke glykosylering rekombinante proteiner

Published: October 04, 2017
doi:
10.3791/56302
, , , , ,
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry,University of Western Ontario

Summary

Biokjemiske og strukturelle analyser av glycosylated proteiner krever relativt store mengder homogen prøver. Her presenterer vi en effektiv kjemisk metode for områdespesifikke glykosylering rekombinante proteiner renset fra bakterier av målretting reaktive Cys thiols.

Abstract

Stromal samhandling molekyl-1 (STIM1) er en type-jeg transmembrane protein ligger på endoplasmatiske retikulum (ER) og plasma membraner (PM). ER-resident STIM1 regulerer aktiviteten til PM Orai1 kanaler i en prosess kjent som lagre styres kalsium (Ca2 +) oppføring som er viktigste Ca2 + signalnettverk prosessen som driver immunrespons. STIM1 gjennomgår post-translasjonell N– glykosylering på to luminal Asn steder på Ca2 + sensing domenet for molekylet. Men den biokjemiske, Biofysiske, og strukturen biologiske effekter av N– glycosylated STIM1 var dårlig forstått til nylig på grunn av en manglende evne til å lett få høye nivåer av homogen N– glycosylated protein. Her beskriver vi gjennomføringen av i vitro kjemiske tilnærming som festes glukose moieties bestemt protein områder for forstå underliggende effekten av N– glykosylering på proteinstruktur og mekanisme. Bruke løsning kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi vurdere vi både effektiviteten av endring og strukturelle konsekvensene av glukose vedlegget med et enkelt utvalg. Denne tilnærmingen kan lett tilpasses for å studere utallige glycosylated proteiner som finnes i naturen.

Introduction

Lagre styres kalsium (Ca2 +) oppføringen (SOCE) er den store sti som immunceller tar opp Ca2 + fra ekstracellulære plass i stoffer. I T-lymfocytter binde T celle reseptorer på plasma membranen (PM) antigener som aktiverer protein tyrosin kinaser (omtalt i 1,2,3). En fosforylering cascade fører til aktivering av fosfolipase-γ (PLCγ) som senere formidler hydrolyse av membran phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) i diacylglycerol og inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3 ). IP3 er en liten diffusible budbringer som binder til IP3 reseptorer (IP3R) på det endoplasmatiske retikulum (ER) og dermed åpne denne reseptoren kanal og tillater Ca2 + å strømme ned konsentrasjon gradient fra ER lumen til stoffer (omtalt i 4). Reseptor signalering fra G protein kombinert og tyrosin kinase reseptorer i en rekke andre nervøs og ikke-nervøs cellen typer føre til samme produksjon av IP3 og aktivering av IP3Rs.

På grunn av begrenset Ca2 + lagringskapasiteten er, IP3-mediert utgivelsen og resulterende økning i cytosolic Ca2 + er bare forbigående; men denne uttømming av ER luminal Ca2 + dypt effekter stromal samhandling molekyl-1 (STIM1), en type-jeg transmembrane (TM) protein hovedsakelig funnet på ER membran 5,6,7. STIM1 inneholder et lumen orienterte Ca2 + sensing domene en EF-hånd par og sterile α-motiv (EFSAM). Tre cytosolic orienterte kveilet-coil domener er atskilt fra EFSAM av enkelt TM domenet (omtalt i 8). På ER luminal Ca2 + utarming gjennomgår EFSAM en destabilisering-kombinert oligomerization 7,9 som forårsaker strukturelle rearrangements TM og kveilet-coil domener 10. Disse strukturelle endringer kulminerte i en overlapping av STIM1 ER-PM veikryss 11,12,13,14 gjennom interaksjoner med PM phosphoinositides 15, 16 og Orai1 underenheter 17,18. Orai1 proteiner er PM underenheter som monterer skjemaet Ca2 + kanaler 19,20,21,22. STIM1-Orai1 vekselsvirkningene på ER-PM veikryss lette en åpen Ca2 + utgivelsen aktivert Ca2 + (CRAC) kanal konformasjon som gjør denne bevegelsen av Ca2 + stoffer fra de høye konsentrasjonene av den ekstracellulære plass. I immunceller, den vedvarende cytosolic Ca2 + høyder via CRAC kanaler indusere av Ca2 +– calmodulin/calcineurin avhengige dephosphorylation av den kjernefysiske faktoren av aktivert T-celler som senere går inn i kjernen og begynner transcriptional regulering av gener fremme T-celle aktivering 1,3. Prosessen med CRAC kanal aktivering av STIM1 23,24 via agonist-indusert ER luminal Ca2 + uttømming og den resulterende vedvarende cytosolic Ca2 + høyden kalles samlet SOCE 25. Den viktige rollen SOCE i T-celler er tydelig ved studier viser at arvelige mutasjoner i både STIM1 og Orai1 kan forårsake alvorlig kombinert immunsvikt syndromer 3,19,26, 27. EFSAM starter SOCE etter sensing ER luminal Ca2 + uttømming via tapet av Ca2 + koordinering på kanonisk EF-hånd, til slutt fører til destabilisering-kombinert selv association 7, 28,29.

Glykosylering er kovalente vedlegg og behandling av oligosaccharide strukturer, også kjent som glykaner, gjennom biosyntetiske trinnene i ER og Golgi (omtalt i 30,32,33). Det er to dominerende typer glykosylering i eukaryoter: N-koblede og O-koblet, avhengig av spesifikke aminosyre og atom bygge bro sammenhengen. I N– glykosylering, legges glykaner side kjede amid av Asn, og i de fleste tilfeller oppstår innledes trinn i ER som polypeptid kjeden flytter inn lumen 34. Det første trinnet i N– glykosylering er overføring av en fjorten-sukker kjernen struktur består av glukose (Glc), mannose (mann) og N– acetylglucosamine (GlcNAc) (dvs. Glc3Man9GlcNAc2) fra en ER membran lipid av en oligosaccharyltransferase 35,36. Ytterligere skritt, for eksempel spalting eller overføring av glukose rester, er katalysert på Akutten av spesifikke glycosidases og glycosyltransferases. Noen proteiner som la ER og flytte til Golgi kan bli ytterligere behandlet 37. O– glykosylering refererer til tillegg av glykaner, vanligvis til side kjede hydroksyl gruppe Ser eller Thr rester, og denne endringen oppstår helt i Golgi komplekset 33,34. Det er flere O– glycan strukturer som kan bestå av N– acetylglucosamine, fucose, galaktose, og sialic syre med hver enkle sukkerarter lagt sekvensielt 33.

Mens ingen bestemt sekvens har blitt identifisert som forutsetning for mange typer O– glykosylering, en felles konsensus-sekvens har blitt assosiert med N-koblet endring: Asn-X-Ser/Thr/Cys, hvor X kan alle aminosyre unntatt Pro 33. STIM1 EFSAM inneholder to av disse konsensus N– glykosylering: Asn131-Trp132-Thr133 og Asn171-Thr172-Thr173. Faktisk har tidligere studier vist at EFSAM kan være N– glycosylated i pattedyrceller på Asn131 og Asn171 38,39,40,41. Men tidligere studier av konsekvensene av N– glykosylering på SOCE er incongruent, tyder undertrykt, kraftig eller ingen effekt av denne post-translasjonell modifikasjon på SOCE aktivisering 38,= “xref” > 39,40,41. Dermed er forskning på de underliggende Biofysiske biokjemiske og strukturelle konsekvensene av EFSAM N– glykosylering viktig å forstå de regulatoriske effektene av denne endringen. På behovet for høye nivåer av homogen proteiner i disse i vitro eksperimenter, ble en område-selektiv tilnærming til covalently fest glukose moieties til EFSAM brukt. Interessant, forårsaket Asn131 og Asn171 glykosylering strukturelle endringer som samles i EFSAM kjernen og forbedre egenskapene Biofysiske som fremmer STIM1-mediert SOCE 42.

Kjemisk vedlegget glycosyl grupper på Cys thiols er blitt godt etablert av banebrytende arbeid som første gang påvist nytten av dette enzymet-fri tilnærming til å forstå det stedsspesifikke effekten av glykosylering på protein funksjonen 43 , 44. nylig og med hensyn til STIM1, Asn131 og Asn171 rester ble mutert til Cys og glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] ble brukt covalently koble glukose til gratis thiols 42. Her beskriver vi denne tilnærmingen som ikke bare bruker mutagenese for å innlemme området bestemte Cys rester for endring, men også gjelder løsning kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) spektroskopi å raskt vurdere endring effektivitet og strukturelle forstyrrelser som følge av glykosylering. Spesielt denne generelle metodikk er lett tilpasses studere virkningene av enten O– eller N– glykosylering av recombinantly produsert protein.

Protocol

1. polymerasekjedereaksjons (PCR)-mediert området-rettet mutagenese for inkorporering av Cys en bakteriell pET-28a uttrykk vektor. Bestemme konsentrasjonen av pET-28a vektor (dvs. dobbel strandet DNA) ved hjelp av en ultrafiolett (UV) utryddelse koeffisient av 0.020 (μg/mL) cm -1 på 260 nm. Syntetisere et par komplementære mutagene primere for hver Cys mutasjon som jeg) det er minst 15 nukleotider komplementære til malen før første base misforholdet og 15 nukleotider utfyll…

Representative Results

Det første trinnet i denne fremgangsmåten krever mutagenese av kandidaten glykosylering rester til Cys rester som kan endres ved hjelp av glukose-5-meter EFSAM har ingen endogene Cys rester, så ingen spesielle hensyn må gjøres før den mutagenese. Imidlertid må innfødt Cys rester være mutert til ikke kan endres rester før du utfører beskrevet kjemi. Minimal effekten den opprinnelige strukturen, foreslår vi at du utfører en global orden justering av protein av interesse og best…

Discussion

Protein glykosylering er en post-translasjonell modifikasjon der sukker covalently knyttet til polypeptides primært gjennom sammenhengene til aminosyre siden kjeder. Så mange som 50% av pattedyr proteiner er glycosylated 54, der glycosylated proteinene kan senere har et variert utvalg av effekter fra endre biomolecular forpliktende tilhørighet, påvirke protein folding, endre kanal aktivitet, målretting molekyler for fornedrelse og cellular handel, for å nevne noen (omtalt i…

Acknowledgements

Denne forskningen ble støttet av naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (05239 til P.B.S.), kanadiske fundament for innovasjon/Ontario Research Fund (til P.B.S.), prostata kreft bekjempe Foundation – Telus Ride for far (til P.B.S.) og Ontario Graduate Scholarship (til Y.J.C. og født).

Materials

Phusion DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530S Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific FERSM1163 Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme New England Biolabs, Inc. R0176 Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit GeneAid, Inc. PDH300 Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli Agilent Technologies, Inc. 230280 Use in step 2.1.
DH5a E. coli Invitrogen, Inc. 18265017 Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter Millipore, Inc. SLGV033RS Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin Thermo Fisher Scientific 88221 Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing BioDesign, Inc. D306 Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin BioPharm Laboratories, Inc. SKU91-055 Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5156-01 Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS Toronto Research Chemicals, Inc. G441000 Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators Sartorius, Inc. VS2001 Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26630 Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5053-01 Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System GE Healthcare, Inc. 29018224 Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer Agilent Technologies, Inc. Use in step 5.2 and 5.5.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).
  2. Feske, S., Skolnik, E. Y., Prakriya, M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 12 (7), 532-547 (2012).
  3. Shaw, P. J., Feske, S. Physiological and pathophysiological functions of SOCE in the immune system. Front Biosci (Elite Ed). 4, 2253-2268 (2012).
  4. Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
  5. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural aspects of calcium-release activated calcium channel function. Channels (Austin). 7 (5), 344-353 (2013).
  6. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structure and function of endoplasmic reticulum STIM calcium sensors. Curr Top Membr. 71, 59-93 (2013).
  7. Stathopulos, P. B., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ames, J. B., Ikura, M. Stored Ca2+ depletion-induced oligomerization of stromal interaction molecule 1 (STIM1) via the EF-SAM region: An initiation mechanism for capacitive Ca2+ entry. J Biol Chem. 281 (47), 35855-35862 (2006).
  8. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Store operated calcium entry: From concept to structural mechanisms. Cell Calcium. , (2016).
  9. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structurally delineating stromal interaction molecules as the endoplasmic reticulum calcium sensors and regulators of calcium release-activated calcium entry. Immunol Rev. 231 (1), 113-131 (2009).
  10. Muik, M., et al. STIM1 couples to ORAI1 via an intramolecular transition into an extended conformation. EMBO J. 30 (9), 1678-1689 (2011).
  11. Luik, R. M., Wang, B., Prakriya, M., Wu, M. M., Lewis, R. S. Oligomerization of STIM1 couples ER calcium depletion to CRAC channel activation. Nature. 454 (7203), 538-542 (2008).
  12. Luik, R. M., Wu, M. M., Buchanan, J., Lewis, R. S. The elementary unit of store-operated Ca2+ entry: local activation of CRAC channels by STIM1 at ER-plasma membrane junctions. J Cell Biol. 174 (6), 815-825 (2006).
  13. Wu, M. M., Buchanan, J., Luik, R. M., Lewis, R. S. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol. 174 (6), 803-813 (2006).
  14. Liou, J., Fivaz, M., Inoue, T., Meyer, T. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+ store depletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9301-9306 (2007).
  15. Calloway, N., et al. Stimulated association of STIM1 and Orai1 is regulated by the balance of PtdIns(4,5)P(2) between distinct membrane pools. J Cell Sci. 124 (Pt 15), 2602-2610 (2011).
  16. Korzeniowski, M. K., et al. Dependence of STIM1/Orai1-mediated calcium entry on plasma membrane phosphoinositides. J Biol Chem. 284 (31), 21027-21035 (2009).
  17. Park, C. Y., et al. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. Cell. 136 (5), 876-890 (2009).
  18. Yuan, J. P., et al. SOAR and the polybasic STIM1 domains gate and regulate Orai channels. Nat Cell Biol. 11 (3), 337-343 (2009).
  19. Feske, S., et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature. 441 (7090), 179-185 (2006).
  20. Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
  21. Vig, M., et al. CRACM1 multimers form the ion-selective pore of the CRAC channel. Curr Biol. 16 (20), 2073-2079 (2006).
  22. Vig, M., et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Science. 312 (5777), 1220-1223 (2006).
  23. Liou, J., et al. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Curr Biol. 15 (13), 1235-1241 (2005).
  24. Roos, J., et al. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol. 169 (3), 435-445 (2005).
  25. Putney, J. W. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium. 7 (1), 1-12 (1986).
  26. Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. 460 (2), 417-435 (2010).
  27. Maus, M., et al. Missense mutation in immunodeficient patients shows the multifunctional roles of coiled-coil domain 3 (CC3) in STIM1 activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6206-6211 (2015).
  28. Stathopulos, P. B., Zheng, L., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ikura, M. Structural and mechanistic insights into STIM1-mediated initiation of store-operated calcium entry. Cell. 135 (1), 110-122 (2008).
  29. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Partial unfolding and oligomerization of stromal interaction molecules as an initiation mechanism of store operated calcium entry. Biochem Cell Biol. 88 (2), 175-183 (2010).
  30. Dennis, J. W., Lau, K. S., Demetriou, M., Nabi, I. R. Adaptive regulation at the cell surface by N-glycosylation. Traffic. 10 (11), 1569-1578 (2009).
  31. Nilsson, T., Au, C. E., Bergeron, J. J. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi apparatus. FEBS Lett. 583 (23), 3764-3769 (2009).
  32. Stanley, P. Golgi glycosylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (4), (2011).
  33. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  34. Gerlach, J., Sharma, S., Leister, K., Joshi, L., Agostinis, P., Afshin, S. . Endoplasmic Reticulum Stress in Health and Disease. , 23-39 (2012).
  35. Pearse, B. R., Hebert, D. N. Lectin chaperones help direct the maturation of glycoproteins in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 684-693 (2010).
  36. Stanley, P., Sundaram, S. Rapid assays for lectin toxicity and binding changes that reflect altered glycosylation in mammalian cells. Curr Protoc Chem Biol. 6 (2), 117-133 (2014).
  37. Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
  38. Csutora, P., et al. Novel role for STIM1 as a trigger for calcium influx factor production. J Biol Chem. 283 (21), 14524-14531 (2008).
  39. Kilch, T., et al. Mutations of the Ca2+-sensing stromal interaction molecule STIM1 regulate Ca2+ influx by altered oligomerization of STIM1 and by destabilization of the Ca2+ channel Orai1. J Biol Chem. 288 (3), 1653-1664 (2013).
  40. Williams, R. T., et al. Stromal interaction molecule 1 (STIM1), a transmembrane protein with growth suppressor activity, contains an extracellular SAM domain modified by N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta. 1596 (1), 131-137 (2002).
  41. Mignen, O., Thompson, J. L., Shuttleworth, T. J. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. 579 (Pt 3), 703-715 (2007).
  42. Choi, Y. J., Zhao, Y., Bhattacharya, M., Stathopulos, P. B. Structural perturbations induced by Asn131 and Asn171 glycosylation converge within the EFSAM core and enhance stromal interaction molecule-1 mediated store operated calcium entry. Biochim Biophys Acta. 1864 (6), 1054-1063 (2017).
  43. Davis, B. G., Lloyd, R. C., Jones, J. B. Controlled site-selective protein glycosylation for precise glycan structure-catalytic activity relationships. Bioorg Med Chem. 8 (7), 1527-1535 (2000).
  44. Gamblin, D. P., van Kasteren, S. I., Chalker, J. M., Davis, B. G. Chemical approaches to mapping the function of post-translational modifications. FEBS J. 275 (9), 1949-1959 (2008).
  45. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Methods Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  46. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Bell, D. J. Mass spectrometry. Methods Mol Biol. 244, 447-454 (2004).
  49. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  50. Farrow, N. A., et al. Backbone Dynamics of a Free and a Phosphopeptide-Complexed Src Homology-2 Domain Studied by N-15 Nmr Relaxation. Biochemistry. 33 (19), 5984-6003 (1994).
  51. Kay, L. E., Keifer, P., Saarinen, T. Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity. Journal of the American Chemical Society. 114 (26), 10663-10665 (1992).
  52. Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  53. Masse, J. E., Keller, R. AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic. J Magn Reson. 174 (1), 133-151 (2005).
  54. Monticelli, M., Ferro, T., Jaeken, J., Dos Reis Ferreira, V., Videira, P. A. Immunological aspects of congenital disorders of glycosylation (CDG): a review. J Inherit Metab Dis. 39 (6), 765-780 (2016).
  55. An, H. J., Kronewitter, S. R., de Leoz, M. L., Lebrilla, C. B. Glycomics and disease markers. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 601-607 (2009).
  56. Wani, W. Y., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V., McMahon, L. L., Zhang, J. O-GlcNAcylation and neurodegeneration. Brain Res Bull. , (2016).
  57. Haines, A. M., Tobe, S. S., Kobus, H. J., Linacre, A. Properties of nucleic acid staining dyes used in gel electrophoresis. Electrophoresis. 36 (6), 941-944 (2015).

Tags

Cysteine ThiolsSite-specific GlycosylationRecombinant ProteinsStructural BiologyGlycosylation PatternsDisease TherapyPCR MutagenesisDPN1 DigestionProtein Expression
check_url/56302?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S., Siddiqui, N., Feng, Q., Stathopulos, P. B. Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. (128), e56302, doi:10.3791/56302 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image