JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Inriktning cystein tioler för in Vitro platsspecifika Glycosylation av rekombinanta proteiner

Published: October 04, 2017
doi:
10.3791/56302
, , , , ,
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry,University of Western Ontario

Summary

Biokemiska och strukturella analyser av glykosylerat proteiner kräver relativt stora mängder homogena prover. Här presenterar vi en effektiv kemisk metod för platsspecifika glycosylation av rekombinanta proteiner renas från bakterier genom att rikta reaktiva Cys tioler.

Abstract

Stromaceller interaktion celladhesionsmolekyl-1 (STIM1) är en typ-jag transmembrane protein ligger på endoplasmatiska nätverket (ER) och plasma membran (PM). ER-resident STIM1 reglerar aktiviteten av PM Orai1 kanaler i en process som kallas lagra manövrerade kalcium (Ca2 +) inträde som är huvudsakliga Ca2 + signalering processen som driver immunsvaret. STIM1 genomgår posttranslationella N– glycosylation på två luminala Asn platser inom Ca2 + fjärranalys domänen av molekylen. Dock den biokemiska, biofysiska, och struktur biologiska effekter av N– glykosylerat STIM1 förstods dåligt tills nyligen på grund av en oförmåga att lätt få höga halter av homogena N– glykosylerat protein. Här, beskriver vi genomförandet av ett in vitro- kemiska tillvägagångssätt som tillmäter specifikt protein platser gäller att förstå underliggande inverkan på Proteiners struktur och mekanism av N– glycosylation glukosenheter. Med hjälp av lösning kärnmagnetisk resonansspektroskopi bedöma vi både effektiviteten av ändringen samt de strukturella konsekvenserna av glukos tillbehöret med ett enda prov. Detta tillvägagångssätt kan lätt anpassas för att studera de otaliga glykosylerat proteiner som finns i naturen.

Introduction

Lagra manövrerade kalcium (Ca2 +) post (SOCE) är den huvudsakliga vägen som immunceller tar upp Ca2 + från extracellulära i cytosolen. I T-lymfocyter binder T-cellreceptorer ligger på plasmamembranet (PM) antigenerna som aktivera proteinet tyrosinkinas (ses i 1,2,3). En fosforylering kaskad leder till aktivering av fosfolipas-γ (PLCγ) som därefter förmedlade hydrolys av membran fosfatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) till diglyceridolja och inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-3 ). IP3 är en liten diffusible budbärare som binder till IP-3 receptorer (IP3R) på det endoplasmatiska retiklet (ER) därmed öppna denna receptor kanal och tillåter Ca2 + att rinna ner koncentrationsgradient från akuten lumen till cytosolen (ses i 4). Receptorn signalering från G-protein kopplade och tyrosin Kinas receptorer i en mängd andra hetsiga och icke-retbara cell typer bly på samma produktion av IP3 och aktivering av IP3Rs.

På grund av ändliga Ca2 + lagringskapaciteten av ER, IP-3-medierad release och resulterande ökning cytosoliska Ca2 + är endast övergående; emellertid, denna utarmning av den ER luminala Ca2 + djupt effekter stromal interaktion celladhesionsmolekyl-1 (STIM1), en typ-jag transmembrana (TM) protein som mestadels finns på ER membran 5,6,7. STIM1 innehåller en lumen-orienterade Ca2 + fjärranalys domän består av en EF-hand par och sterila α-motiv (EFSAM). Tre cytosoliska-orienterade dubbeltvinnade domäner skiljs från EFSAM genom den enda TM domänen (över 8). Vid ER luminala Ca2 + utarmning genomgår EFSAM en destabilisering-kopplade oligomerisering 7,9 som orsakar strukturella rearrangements av TM och dubbeltvinnade domäner 10. Dessa strukturella förändringar kulminera i en svällning av STIM1 ER-PM korsningar 11,12,13,14 genom interaktioner med PM phosphoinositides 15, 16 och Orai1 subenheter 17,18. Orai1 proteiner är PM subunitsna som monterar till form Ca2 + kanaler 19,20,21,22. STIM1-Orai1 interaktioner i ER-PM korsningar underlätta en öppen Ca2 + release aktiveras Ca2 + (CRAC) kanal konformation som möjliggör förflyttning av Ca2 + till cytosolen från de höga koncentrationerna av den extracellulära. I immunceller, den ihållande cytosoliska Ca2 + förhöjt via CRAC kanaler inducera de Ca2 +– calmodulin/kalcineurin beroende Defosforylering av nuclear factor av aktiverade T-celler som därefter in i kärnan och börjar Transkriptionsreglering av gener att främja T-cells aktivering 1,3. Processen för CRAC kanal aktivering av STIM1 23,24 via agonist-inducerad ER luminala Ca2 + utarmning och den resulterande ihållande cytosoliska Ca2 + höjden kallas kollektivt SOCE 25. SOCE i T-cellerna vitala roll framgår av studier som visar att ärftliga mutationer i både STIM1 och Orai1 kan orsaka svår kombinerad immunbrist syndrom 3,19,26, 27. EFSAM initierar SOCE efter avkänning ER-luminala Ca2 + utarmning via förlust av Ca2 + samordning på den kanoniska EF-handen, vilket slutligen leder till destabilisering-kopplade själv association 7, 28,29.

Glycosylation är kovalent fastsättning och bearbetning av oligosackarid strukturer, även känd som glycans, genom olika biosyntetiska stegen i ER och Golgi (över 30,32,33). Det finns två dominerande typer av glycosylation i Eukaryoter: N-länkade och O-kopplad, beroende på specifik aminosyra och atom överbrygga kopplingen. I N– glycosylation, glycans är kopplade till den side chain amiden av Asn, och i de flesta fall uppstår det inledande steget i ER som polypeptiden kedjan flyttar in i lumen 34. Det första steget av N– glycosylation är överföring av en fjorton-socker kärna struktur består av glukos (Glc), mannos (Man) och N– acetylglukosamin (GlcNAc) (dvs Glc3Man9GlcNAc2) från en ER membran lipider av en oligosaccharyltransferase 35,36. Ytterligare steg, exempelvis klyvning eller överföring av glukos rester, är katalyseras i ER av specifika glycosidases och glykosyltransferaser. Vissa proteiner som lämnar ER och flytta in i Golgi kan finnas ytterligare bearbetade 37. O– glycosylation avser tillägg av glycans, oftast till side chain hydroxylgruppen Ser eller Thr resthalter, och denna ändring sker helt i den Golgi komplex 33,34. Det finns flera O– glycan strukturer som kan bestå av N– acetylglukosamin, fukos, galaktos och sialic acid med varje monosackarid lagt till sekventiellt 33.

Medan ingen specifik sekvens har identifierats som förutsättning för många typer av O– glycosylation, en gemensam samsyn sekvens har associerats med N-länkade modifiering: Asn-X-Ser/Thr/Cys, där X kan vara någon aminosyra Förutom Pro 33. STIM1 EFSAM innehåller två av dessa samförstånd N– glycosylation platser: Asn131-Trp132-Thr133 och Asn171-Thr172-Thr173. Tidigare studier har faktiskt visat att EFSAM kan vara N– glykosylerat i däggdjursceller vid Asn131 och Asn171 38,39,40,41. Men tidigare studier av konsekvenserna av N– glycosylation på SOCE har inkonsekvens, vilket tyder på undertryckt, betablockerare eller ingen effekt av denna posttranslationella modifieringen på SOCE aktiveringen 38,= ”xref” > 39,40,41. Forskning om underliggande biofysiska, biokemiska och strukturella konsekvenser av EFSAM N– glycosylation är således mycket viktigt att begripa de rättsliga effekterna av denna ändring. På grund av kravet på för höga nivåer av homogena proteiner i dessa in vitro- experiment tillämpades en webbplats-selektiv strategi att fästa kovalent glukosenheter EFSAM. Intressant, orsakade Asn131 och Asn171 glycosylation strukturella förändringar som konvergerar inom den EFSAM kärnan och öka biofysiska egenskaper som främjar STIM1-medierad SOCE 42.

Kemisk fastsättning av glycosyl grupper till Cys tioler har varit väl etablerade av ett banbrytande arbete som först visat nyttan av detta enzym-fri sätt att förstå glycosylation platsspecifika effekter på protein funktion 43 , 44. mer nyligen och med avseende på STIM1, Asn131 och Asn171 rester var muterat till Cys och glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] användes kovalent länka glukos till gratis tioler 42. Här, beskriver vi detta synsätt som inte bara använder mutagenes för att införliva specifika Cys restmängder för modifiering, men gäller även lösning kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi för att snabbt bedöma både modifiering effektivitet och struktur störningar till följd av glycosylation. Noterbart här allmän metod är lätt anpassningsbar för att studera effekterna av antingen O– eller N– glycosylation någon recombinantly produceras protein.

Protocol

1. polymeras-kedjereaktion (PCR)-medierad webbplats riktad mutagenes för införlivandet av Cys i en bakteriell pET-28a uttryck vektor. Bestämma koncentrationen av pET-28a vektorn (dvs dubbel stranded DNA) med en ultraviolett (UV) extinktionskoefficient 0,020 (μg/mL) cm -1 vid 260 nm. Syntetisera ett par kompletterande mutagena primers för varje Cys mutation sådan att jag) finns det minst 15 nukleotider kompletterar mallen innan första bas obalansen och 15 nukleotider komplet…

Representative Results

Det första steget i detta tillvägagångssätt kräver mutagenicitet av kandidat glycosylation rester till Cys resthalter som kan vara modifierbara använder den glukos-5-MTS. EFSAM har inga endogena Cys-rester, så inga särskilda överväganden måste göras före den mutagenes. Infödda Cys rester måste dock vara muterat till icke-ändringsbara rester innan du utför beskrivs kemi. För att minimalt effekt infödda struktur, föreslår vi att utföra en global ordning justering av pr…

Discussion

Protein glycosylation är en post-translationella ändring där socker är kovalent kopplade till polypeptider främst genom kopplingar till aminosyra sida kedjor. Så många som 50% av protein från däggdjur är glykosylerat 54, där glykosylerat proteinerna kan därefter ha ett varierat utbud av effekter från att ändra Biomolekylär affinitet, påverka protein vikning, att ändra kanal verksamhet, inriktning molekyler för nedbrytning och cellulära människohandel, för att nämna några (ö…

Acknowledgements

Denna forskning stöddes av de naturliga vetenskaperna och Engineering Research Council of Canada (05239 till PBS), kanadensiska Institutet för Innovation/Ontario forskningsfond (till PBS), prostata Cancer slåss Foundation – Telus Ride för pappa (till PBS) och Ontario Graduate stipendium (till Y.J.C. och N.S.).

Materials

Phusion DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530S Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific FERSM1163 Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme New England Biolabs, Inc. R0176 Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit GeneAid, Inc. PDH300 Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli Agilent Technologies, Inc. 230280 Use in step 2.1.
DH5a E. coli Invitrogen, Inc. 18265017 Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter Millipore, Inc. SLGV033RS Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin Thermo Fisher Scientific 88221 Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing BioDesign, Inc. D306 Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin BioPharm Laboratories, Inc. SKU91-055 Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5156-01 Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS Toronto Research Chemicals, Inc. G441000 Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators Sartorius, Inc. VS2001 Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26630 Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5053-01 Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System GE Healthcare, Inc. 29018224 Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer Agilent Technologies, Inc. Use in step 5.2 and 5.5.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).
  2. Feske, S., Skolnik, E. Y., Prakriya, M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 12 (7), 532-547 (2012).
  3. Shaw, P. J., Feske, S. Physiological and pathophysiological functions of SOCE in the immune system. Front Biosci (Elite Ed). 4, 2253-2268 (2012).
  4. Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
  5. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural aspects of calcium-release activated calcium channel function. Channels (Austin). 7 (5), 344-353 (2013).
  6. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structure and function of endoplasmic reticulum STIM calcium sensors. Curr Top Membr. 71, 59-93 (2013).
  7. Stathopulos, P. B., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ames, J. B., Ikura, M. Stored Ca2+ depletion-induced oligomerization of stromal interaction molecule 1 (STIM1) via the EF-SAM region: An initiation mechanism for capacitive Ca2+ entry. J Biol Chem. 281 (47), 35855-35862 (2006).
  8. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Store operated calcium entry: From concept to structural mechanisms. Cell Calcium. , (2016).
  9. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structurally delineating stromal interaction molecules as the endoplasmic reticulum calcium sensors and regulators of calcium release-activated calcium entry. Immunol Rev. 231 (1), 113-131 (2009).
  10. Muik, M., et al. STIM1 couples to ORAI1 via an intramolecular transition into an extended conformation. EMBO J. 30 (9), 1678-1689 (2011).
  11. Luik, R. M., Wang, B., Prakriya, M., Wu, M. M., Lewis, R. S. Oligomerization of STIM1 couples ER calcium depletion to CRAC channel activation. Nature. 454 (7203), 538-542 (2008).
  12. Luik, R. M., Wu, M. M., Buchanan, J., Lewis, R. S. The elementary unit of store-operated Ca2+ entry: local activation of CRAC channels by STIM1 at ER-plasma membrane junctions. J Cell Biol. 174 (6), 815-825 (2006).
  13. Wu, M. M., Buchanan, J., Luik, R. M., Lewis, R. S. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol. 174 (6), 803-813 (2006).
  14. Liou, J., Fivaz, M., Inoue, T., Meyer, T. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+ store depletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9301-9306 (2007).
  15. Calloway, N., et al. Stimulated association of STIM1 and Orai1 is regulated by the balance of PtdIns(4,5)P(2) between distinct membrane pools. J Cell Sci. 124 (Pt 15), 2602-2610 (2011).
  16. Korzeniowski, M. K., et al. Dependence of STIM1/Orai1-mediated calcium entry on plasma membrane phosphoinositides. J Biol Chem. 284 (31), 21027-21035 (2009).
  17. Park, C. Y., et al. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. Cell. 136 (5), 876-890 (2009).
  18. Yuan, J. P., et al. SOAR and the polybasic STIM1 domains gate and regulate Orai channels. Nat Cell Biol. 11 (3), 337-343 (2009).
  19. Feske, S., et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature. 441 (7090), 179-185 (2006).
  20. Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
  21. Vig, M., et al. CRACM1 multimers form the ion-selective pore of the CRAC channel. Curr Biol. 16 (20), 2073-2079 (2006).
  22. Vig, M., et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Science. 312 (5777), 1220-1223 (2006).
  23. Liou, J., et al. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Curr Biol. 15 (13), 1235-1241 (2005).
  24. Roos, J., et al. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol. 169 (3), 435-445 (2005).
  25. Putney, J. W. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium. 7 (1), 1-12 (1986).
  26. Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. 460 (2), 417-435 (2010).
  27. Maus, M., et al. Missense mutation in immunodeficient patients shows the multifunctional roles of coiled-coil domain 3 (CC3) in STIM1 activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6206-6211 (2015).
  28. Stathopulos, P. B., Zheng, L., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ikura, M. Structural and mechanistic insights into STIM1-mediated initiation of store-operated calcium entry. Cell. 135 (1), 110-122 (2008).
  29. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Partial unfolding and oligomerization of stromal interaction molecules as an initiation mechanism of store operated calcium entry. Biochem Cell Biol. 88 (2), 175-183 (2010).
  30. Dennis, J. W., Lau, K. S., Demetriou, M., Nabi, I. R. Adaptive regulation at the cell surface by N-glycosylation. Traffic. 10 (11), 1569-1578 (2009).
  31. Nilsson, T., Au, C. E., Bergeron, J. J. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi apparatus. FEBS Lett. 583 (23), 3764-3769 (2009).
  32. Stanley, P. Golgi glycosylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (4), (2011).
  33. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  34. Gerlach, J., Sharma, S., Leister, K., Joshi, L., Agostinis, P., Afshin, S. . Endoplasmic Reticulum Stress in Health and Disease. , 23-39 (2012).
  35. Pearse, B. R., Hebert, D. N. Lectin chaperones help direct the maturation of glycoproteins in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 684-693 (2010).
  36. Stanley, P., Sundaram, S. Rapid assays for lectin toxicity and binding changes that reflect altered glycosylation in mammalian cells. Curr Protoc Chem Biol. 6 (2), 117-133 (2014).
  37. Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
  38. Csutora, P., et al. Novel role for STIM1 as a trigger for calcium influx factor production. J Biol Chem. 283 (21), 14524-14531 (2008).
  39. Kilch, T., et al. Mutations of the Ca2+-sensing stromal interaction molecule STIM1 regulate Ca2+ influx by altered oligomerization of STIM1 and by destabilization of the Ca2+ channel Orai1. J Biol Chem. 288 (3), 1653-1664 (2013).
  40. Williams, R. T., et al. Stromal interaction molecule 1 (STIM1), a transmembrane protein with growth suppressor activity, contains an extracellular SAM domain modified by N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta. 1596 (1), 131-137 (2002).
  41. Mignen, O., Thompson, J. L., Shuttleworth, T. J. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. 579 (Pt 3), 703-715 (2007).
  42. Choi, Y. J., Zhao, Y., Bhattacharya, M., Stathopulos, P. B. Structural perturbations induced by Asn131 and Asn171 glycosylation converge within the EFSAM core and enhance stromal interaction molecule-1 mediated store operated calcium entry. Biochim Biophys Acta. 1864 (6), 1054-1063 (2017).
  43. Davis, B. G., Lloyd, R. C., Jones, J. B. Controlled site-selective protein glycosylation for precise glycan structure-catalytic activity relationships. Bioorg Med Chem. 8 (7), 1527-1535 (2000).
  44. Gamblin, D. P., van Kasteren, S. I., Chalker, J. M., Davis, B. G. Chemical approaches to mapping the function of post-translational modifications. FEBS J. 275 (9), 1949-1959 (2008).
  45. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Methods Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  46. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Bell, D. J. Mass spectrometry. Methods Mol Biol. 244, 447-454 (2004).
  49. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  50. Farrow, N. A., et al. Backbone Dynamics of a Free and a Phosphopeptide-Complexed Src Homology-2 Domain Studied by N-15 Nmr Relaxation. Biochemistry. 33 (19), 5984-6003 (1994).
  51. Kay, L. E., Keifer, P., Saarinen, T. Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity. Journal of the American Chemical Society. 114 (26), 10663-10665 (1992).
  52. Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  53. Masse, J. E., Keller, R. AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic. J Magn Reson. 174 (1), 133-151 (2005).
  54. Monticelli, M., Ferro, T., Jaeken, J., Dos Reis Ferreira, V., Videira, P. A. Immunological aspects of congenital disorders of glycosylation (CDG): a review. J Inherit Metab Dis. 39 (6), 765-780 (2016).
  55. An, H. J., Kronewitter, S. R., de Leoz, M. L., Lebrilla, C. B. Glycomics and disease markers. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 601-607 (2009).
  56. Wani, W. Y., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V., McMahon, L. L., Zhang, J. O-GlcNAcylation and neurodegeneration. Brain Res Bull. , (2016).
  57. Haines, A. M., Tobe, S. S., Kobus, H. J., Linacre, A. Properties of nucleic acid staining dyes used in gel electrophoresis. Electrophoresis. 36 (6), 941-944 (2015).

Tags

Cysteine ThiolsSite-specific GlycosylationRecombinant ProteinsStructural BiologyGlycosylation PatternsDisease TherapyPCR MutagenesisDPN1 DigestionProtein Expression
check_url/56302?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S., Siddiqui, N., Feng, Q., Stathopulos, P. B. Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. (128), e56302, doi:10.3791/56302 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image