تحليل للخلايا المناعية في واحد الوركي الأعصاب والعقدة الظهرية الجذرية من ماوس واحدة باستخدام التدفق الخلوي
Summary
التحليل الكمي لمحتوى الخلية داخل العصب الوركي مورين أمر صعب نظراً لندرة هذه الأنسجة. ويصف هذا البروتوكول وسيلة لهضم الأنسجة والإعداد التي توفر خلايا كافية للتحليل الخلوي تدفق السكان الخلايا المناعية من الأعصاب من الفئران الفردية.
Abstract
الخلايا المناعية المقيم في الأعصاب في الجهاز العصبي المحيطي (PNS) ضرورية للحفاظ على سلامة الخلايا العصبية في عصب صحية. الخلايا المناعية من السندات الإذنية تتأثر بالإصابة والمرض، والتي تؤثر على وظيفة العصب وقدرتها على التجدد. عادة يتم تحليل الخلايا المناعية العصبية من الفلورة (إذا كان). بينما إذا كانت ضرورية لتحديد موقع الخلايا المناعية في العصب، إذا كان فقط نصف الكمية والأسلوب الذي يقتصر على عدد العلامات التي يمكن تحليلها في وقت واحد ودرجة التعبير السطحي. واستخدمت في هذه الدراسة، التدفق الخلوي للتحليل الكمي لتسلل الكريات البيض إلى الأعصاب الوركي أو الجذرية الظهرية جانجليونس (باﻷسعار) من الفئران الفردية. تم إجراء تحليل خلية مفردة باستخدام DAPI وحللت العديد من البروتينات في نفس الوقت للتعبير سواء السطحية أو داخل الخلايا. ولدت الأعصاب الوركي كلا من الماوس واحدة التي يعاملون وفقا لهذا البروتوكول ≥ 30,000 الأحداث الأنوية وحيدة. نسبة الكريات البيضاء في الأعصاب الوركي، يحددها التعبير عن CD45، كان حوالي 5% محتوى خلية الإجمالي في العصب الوركي وحوالي 5-10% في الرسم. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز أساسا على السكان الخلايا المناعية داخل السندات الإذنية، مرونة التدفق الخلوي لقياس عدد من علامات في وقت واحد يعني أن السكان خلايا أخرى موجودة داخل العصب، مثل خلايا شوان، بيريسيتيس ، الخلايا الليفية، وخلايا بطانية، يمكن أيضا أن تحلل باستخدام هذا الأسلوب. ولذلك توفر هذه الطريقة وسيلة جديدة لدراسة التأثيرات الجهازية على السندات الإذنية، مثل نيوروتوكسيكولوجي والنماذج الوراثية للاعتلال العصبي أو الأمراض المزمنة، مثل داء السكري.
Introduction
الخلايا المناعية التي أدخل السندات الإذنية من التداول، حسب تعريف التعبير عن CD45 و CD11b، يساعد على المحافظة على سلامة العصب وتلعب دوراً على حد سواء في التجدد وانحطاط1. يمكن أن تكون منحرفة الضامة (المعرفة بواسطة التعبير عنها من CD68 في الماوس) نحو النمط الظاهري تحريضية، التعبير عن MHC أكثر من الدرجة الثانية و CD86 على سطحها (M1)، أو نحو النمط الظاهري للالتهابات، معربا عن مزيد من CD206 داخل الخلايا (M2)2 . انحراف من النمط الظاهري بلعم عملية دينامية وينظم من خلال Akt مما يشير إلى3، والتي تعكس مختلف مهام الضامة في الدفاع ضد العوامل الممرضة (M1) والدور في تجديد الأنسجة (M2). يتطلب التجديد العصب المتضرر أولاً البلعمه حطام المايلين التي الضامة في العصب4،5، والالتهابات (CD68+CD206+) أظهرت الضامة M2 لتعزيز ثمرة إكسون في 6من السندات الإذنية. انخفاض التوظيف أو الضامة للسندات الإذنية، أو قد يؤدي ضعف القدرة على البلعمه في التجدد البصر والحفاظ على سلامة الأعصاب. التهابات الضامة M1، التعبير عن MHC الدرجة الثانية، أقل قدرة على البلعمه من الضامة M2، والتهاب الخلايا العصبية المتورطة في الآلية المرضية لعدة أمراض الأعصاب7.
التغييرات التي تحدث للأعصاب المناعي المقيم نتيجة للأضرار التي قد تكون كمية، يظهر في فقدان CD45+ الكريات البيضاء (أو زيادة تسلل CD45+ الكريات البيضاء في حالة التهاب)، أو نوعية، مثل تغيير النمط الظاهري بلعم من M2 إلى النمط الظاهري M1. قد تم تحليلها في خلايا المناعة من السندات الإذنية تقليديا عن طريق إذا، استخدام الأجزاء المجمدة أو المواد جزءا لا يتجزأ من البارافين8. إذا كانت مطلوبة من أجل تحديد ترجمة الخلايا للفائدة. ومع ذلك، استخدام القياس الكمي إذا غالباً ما يعتمد على عد عدد صغير نسبيا من الخلايا في مقطع ضيقة للأنسجة، مما يجعل التقدير الكمي لا يمكن الاعتماد عليها وعرضه لتحيز الانتقاء. للتعرف على مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية، تزامن الكشف عن علامات خارج الخلية و/أو داخل الخلايا المطلوب، بينما يتطلب تحديد النمط الظاهري بلعم علامات على الأقل اثنين على الأقل، على وجه التحديد، CD206 و MHC الفئة الثانية. كما الأكثر شيوعاً مجاهر المتاحة تقتصر على قنوات الألوان اثنين على الأقل، مثل fluorescein isothiocyanate (فيتك) وفيكوريثرين (PE)، وصف مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية التي إذا يمكن أن تتطلب التقييدية وغير مكتملة، الحاجة إلى وجود عدة شرائح، مستمدة من نفس المنطقة من الفائدة، الملون، وحلل بالتوازي. هذا الجانب تستغرق وقتاً طويلاً ولذلك لا تصلح اللازمة لتحليل عينات كبيرة من مجموعات. وعلاوة على ذلك، أن معظم من علامات الاهتمام من خارج الخلية، يمكن الكشف في الأنسجة، والتي أما تم تضمينها في البارافين أو كريوكونسيرفيد، إشكالية بسبب الإخلال بسلامة الغشاء والإخفاء من [ابيتوبس]، فضلا عن فقدان مولدات المضادات للفائدة من استخدام المذيبات، مثل الأسيتون والميثانول9.
في المقابل، التدفق الخلوي، الذي يقيس الضوئية والأسفار خصائص الخلايا المفردة في تعليق كما أنها تمر عبر شعاع من الضوء، يوفر وسيلة أكثر عملية وشاملة لتحليل السكان الخلية. التدفق الخلوي، بدلاً من إنتاج صورة رقمية للأنسجة، ويقدم القياس الكمي الآلي لتعيين المعلمات، التي تشمل الحجم النسبي للخلية ومؤشر يعكس، يشار إلى الأمام مبعثر (FSC)، تعقد الحبوبية/الداخلية أو الجانب-مبعثر (SSC)، وكثافة نسبية الأسفار، توفير أن الخلية قد وصفت مع فلوروفوري مناسبة، مثل جسم مترافق. Cytometer تدفق نموذجي يتكون من اثنين، الليزر تبريد الهواء؛ ليزر أرجون وتنتج الضوء الأزرق في 488 نانومتر وليزر هيليوم نيون ينتج ضوء في 633 نانومتر. هذه التركيبة تسمح لكشف وقياس، وفي نفس الوقت، مالا يقل عن خمسة أهداف على السطح أو داخل المقصورة داخل الخلايا. يمكن أن تتكون سيتوميتيرس تدفق أكثر تقدما من أشعة الليزر المتعددة، والتي تسمح للكشف عن فلوروتشروميس مختلفة تصل إلى ثمانية في وقت واحد، مما يوفر عدم تداخل موجات انبعاثات الذروة من فلوروتشروميس المحدد إلى حد كبير.
لتحليل بالتدفق الخلوي، الأنسجة للفائدة يجب أولاً أن انزيماتيكالي يهضم، عموما مع كولاجيناز، توليد تعليق خلية واحدة. تحليل مورين الوركي الأعصاب كانت صعبة بسبب كمية صغيرة من الأنسجة التي تم الحصول عليها من كل الماوس. وباﻹضافة إلى ذلك، محتوى الدهون عالية المايلين حول محاور عصبية يعوق الانتعاش الخلية وتنتج كميات كبيرة من الحطام. الأسلوب الموصوفة هنا لإعداد العصب الوركي والهضم تم تكييفها من بروتوكول عزل خلايا شوان المشبك et al. 7، ويهدف إلى عزل خلايا كافية من أعصاب الفئران الفردية لتحليل التدفق الخلوي، بغية الحد من التباين بين الفئران. استخدام DAPI لتحديد خلايا مفردة في خلاصة النسيج الخام التي تلتف على ضرورة إزالة الحطام إكسون، الأمر الذي يؤدي عادة إلى فقدان الخلية. الغسيل عدة مرات مع الإيدز عازلة المنظفات الغنية في الإفراج عن الخلايا محاصرين داخل الحطام الدهنية، مما يؤدي إلى زيادة المحصول. الهضم من كلا الأعصاب الوركي كاملة الطول من ماوس واحدة وفقا لهذا البروتوكول يولد إيه ثري زيرو، 000 الأحداث الأنوية واحد وتم استرداد على الأقل 3 إضعاف هذا العدد من الرسم. نسبة CD45+ الكريات البيضاء بحوالي 5 في المائة محتوى خلية الإجمالي في الخلاصة العصب الوركي وحوالي 5-10% في الخلاصة DRG. غالبية CD45+ الخلايا في العصب الوركي أعرب عن علامات بلعم، CD68 و CD206.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأعصاب الوركي تحتوي على نسبة كبيرة من الدهون، مثل نسبة الكولسترول في الدم، بسبب محتوى المايلين حول محاور عصبية. نظراً لتغيير الخصائص للدهون مع درجة الحرارة، يمكن الحصول على نتائج مختلفة عند درجات حرارة مختلفة. لضمان الحفاظ على الخلية، وكافة الخطوات في هذا البروتوكول بعد الهضم أجريت على …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة وأيده الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG؛ SFB1118). الكتاب يود أن يشكر إكسيل إيرهارت لأداء معظم التشريح ومفيد في نقل هذه المعارف، والدكتور فولكر اكستين للمساعدة في الجانب التقني ل cytometer التدفق.
Materials
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve – tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies?. Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -. M., Leong, A. S. -. Y. How does antigen retrieval work?. Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
