Analyse van immuuncellen in één ischiadicus zenuwen en achterwortelganglia Ganglion uit een enkele muis met behulp van Stroom Cytometry
Summary
Kwantitatieve analyse van de inhoud van de cel binnen de nervus ischiadicus lymfkliertest is moeilijk te wijten aan de schaarste van het weefsel. Dit protocol beschrijft een methode voor de vertering van het weefsel en voorbereiding waarmee voldoende cellen voor stroom cytometry analyse van individuele muizen immuun cel populaties van zenuwen.
Abstract
Zenuw-ingezeten immune cellen in het perifere zenuwstelsel (PNS) zijn essentieel voor het behoud van de integriteit van de neuronale in een gezonde zenuw. De immuun cellen van de PNS worden beïnvloed door letsel of ziekte, die de functie van de zenuw en de capaciteit voor regeneratie. Neuronale immuuncellen worden vaak geanalyseerd door immunofluorescentie (IF). Terwijl als is essentieel voor het bepalen van de locatie van de immuuncellen in de zenuw, of ligt op semi-kwantitatieve en de methode is beperkt tot het aantal markeringen die gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd en de mate van expressie van de oppervlakte. In deze studie, werd stroom cytometry gebruikt voor de kwantitatieve analyse van infiltratie van de leukocyten in de ischiadicus zenuwen of achterwortelganglia ganglion (DRG) van individuele muizen. Eencellige analyse werd uitgevoerd met behulp van de DAPI en verschillende eiwitten gelijktijdig werden geanalyseerd voor oppervlakte of intracellulaire expressie. Beide ischiadicus zenuwen van een muis die werden behandeld volgens dit protocol gegenereerd ≥ 30.000 één genucleëerde gebeurtenissen. Het aantal leukocyten in de ischiadicus zenuwen, bepaald door de uitdrukking van CD45, was ongeveer 5% van de inhoud van de cel Totaal in de nervus ischiadicus en ongeveer 5-10% in de Deutsche Reichsbahn. Hoewel dit protocol richt zich vooral op het immuunsysteem celpopulatie binnen de PNS, betekent de flexibiliteit van cytometry van de stroom te meten een aantal markeringen gelijktijdig dat de andere cellen populaties aanwezig zijn binnen de zenuw, zoals de cellen van Schwann, pericytes , fibroblasten, endotheliale cellen, en kunnen ook worden geanalyseerd met behulp van deze methode. Deze methode biedt daarom een nieuw middel voor de studie van systemische effecten op de PNS, zoals neurotoxicology en genetische modellen van neuropathie of in chronische ziekten, zoals diabetes.
Introduction
Immune cellen die de PNS uit de omloop genomen invoeren, bijdragen zoals gedefinieerd door de uitdrukking van CD45 en CD11b, tot de integriteit van de zenuw te behouden en spelen een rol, zowel in regeneratie en degeneratie1. Macrofagen (gedefinieerd door hun uitdrukking van CD68 in muis) kunnen worden scheefgetrokken naar een inflammatoire fenotype, uiten meer MHC klasse II en CD86 op hun oppervlakte (M1), of naar een anti-inflammatoire fenotype, uiting geven aan meer intracellulaire CD206 (M2)2 . Scheeftrekken van de macrofaag fenotype is een dynamisch proces geregeld via Akt3signalering, als gevolg van de verschillende taken van macrofagen in de verdediging tegen ziekteverwekkers (M1) en de rol in weefselregeneratie (M2). Regeneratie van een gewonde zenuw vereist eerst fagocytose van myeline puin door macrofagen in de zenuw4,5, en anti-inflammatoire (CD68+CD206+) macrofagen M2 is aangetoond dat het bevorderen van axon uitgroei in de PNS6. Aanwerving of macrofagen teruggebracht tot de PNS, of verminderde capaciteit voor fagocytose kan leiden tot verminderde regeneratie en handhaving van de integriteit van de zenuw. Inflammatoire M1 macrofagen, uitdrukken van de MHC klasse II, zijn minder geschikt voor fagocytose dan M2 macrofagen en neuronale ontsteking is betrokken bij de pathogenese van verschillende neurodegeneratieve ziekten7.
De veranderingen die aan de resident zenuw-immuunsysteem als gevolg van schade optreden kunnen worden kwantitatieve, manifesteren in verlies van CD45+ leukocyten (of verhoogd infiltratie van CD45+ leukocyten in de zaak ontsteking), of kwalitatieve, zoals wijzigen van macrofaag fenotype van M2 in M1 fenotype. De immuun cellen van de PNS hebben traditioneel zijn geanalyseerd door middel van IF, met behulp van bevroren secties of paraffine-ingebedde materiële8. Indien nodig voor de bepaling van de lokalisatie van de cellen van belang is. Echter kwantificering met behulp van als vaak is gebaseerd op het tellen van een relatief klein aantal cellen in een smalle gedeelte van het weefsel, waardoor kwantificering onbetrouwbaar en kwetsbaar voor selectie bias. Voor de identificatie van specifieke deelverzamelingen van immune cellen is het gelijktijdige detecteren van merkers van extracellulaire en/of intracellulaire vereist, terwijl de vaststelling van het fenotype van de macrofaag vereist ten minste ten minste twee markers, specifiek CD206 en MHC klasse II. Zoals meestal beschikbaar microscopen zijn beperkt tot ten minste twee-kleurkanalen, zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en phycoerythrin (PE), kunnen omvat de karakterisering van de specifieke subsets van immune cellen door als beperkend en onvolledig, waarvoor de noodzaak om meerdere dia’s, afgeleid van het zelfde gebied van belang, die zijn gekleurd en geanalyseerd in parallel. Dit tijdrovende aspect daarom niet nodig zich leent voor de analyse van grote steekproef sets. Bovendien, zoals de meeste van de markers van belang zijn extracellulaire, de detectie in weefsel, dat is ofwel ingebed in paraffine of cryoconserved, kunnen problematisch vanwege de verstoring van de membraan integriteit en het maskeren van epitopes, alsmede het verlies van de antigenen van belang van het gebruik van oplosmiddelen, zoals aceton en methanol9.
Daarentegen stroom cytometry, die optische meet en fluorescentie kenmerken van afzonderlijke cellen in suspensie als ze passeren een lichtstraal, biedt een meer praktische en uitgebreide middelen voor analyse van de populaties van de cel. Stroom cytometry, in plaats van het produceren van een digitaal beeld van het weefsel, biedt een geautomatiseerde kwantificering van instellen van parameters, waaronder de relatieve omvang en reflecterende index, hierna aangeduid als de voorwaartse scatter (FSC), granulariteit/interne complexiteit van een cel of zijde-scatter (SSC), en de intensiteit van de relatieve fluorescentie, verstrekken dat de cel heeft het label met een geschikte fluorophore, zoals een geconjugeerd antilichaam. Een typisch stroom-cytometer bestaat uit twee, luchtgekoelde lasers; een laser argon produceert blauw licht op 488 nm en een helium neon laser produceert licht aan 633 nm. Deze combinatie kan voor de detectie en meting, gelijktijdig, van ten minste vijf doelstellingen op het oppervlak of binnen het intracellulaire compartiment. Meer geavanceerde flow cytometers kan bestaan uit meerdere lasers, die voorzien in de opsporing van maximaal acht verschillende fluorochromes tegelijk, bieden dat de piek emissie golflengten van de geselecteerde fluorochromes niet aanzienlijk overlappen.
Voor het analyseren van stroom cytometry, moet het weefsel van belang eerst worden enzymatisch verteerd, meestal met collagenase, voor het genereren van een eencellige schorsing. De analyse van lymfkliertest ischiadicus zenuwen eerder moeilijk geweest als gevolg van de kleine hoeveelheid weefsel verkregen elke muis. Bovendien, het hoge vetgehalte van de myeline rond de axonen cel herstel belemmert en produceert grote hoeveelheden puin. De methode voor de voorbereiding van de nervus ischiadicus en spijsvertering hierin beschreven werd aangepast van het protocol van de isolatie van Schwann cel van Barrette et al. 7en wil isoleren genoeg cellen uit zenuwen van individuele muizen voor stroom cytometry analyse, teneinde de variatie tussen muizen. Met behulp van de DAPI voor de identificatie van afzonderlijke cellen in de ruwe weefsel digest omzeilt de noodzaak om te verwijderen van axon puin, die vaak tot verlies van de cel leidt. Wassen meerdere malen met een wasmiddel-rijke buffer aids in de release van cellen gevangen binnen het vette puin, waardoor het rendement. Vertering van beide full-length ischiadicus zenuwen van een enkele muis volgens dit protocol genereert ≥30, 000 één genucleëerde evenementen en ten minste 3 keer dat nummer was ontvangen van de Deutsche Reichsbahn. Het aandeel van de CD45+ leukocyten was ongeveer 5% van de inhoud van de cel Totaal in de nervus ischiadicus digest en ongeveer 5-10% in de DRG-digest. De meerderheid van de CD45+ cellen in de nervus ischiadicus uitgedrukt de macrofaag markers, CD68 en CD206.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ischiadicus zenuwen bevatten een groot aantal lipiden, zoals cholesterol, als gevolg van de inhoud van myeline rond de axonen. Aangezien de eigenschappen van lipiden met temperatuur veranderen, kunnen verschillende resultaten bij verschillende temperaturen worden verkregen. Conservering van de cel, werden alle stappen in dit protocol na de spijsvertering uitgevoerd op het ijs. Terwijl de consistentie wordt aanbevolen omwille van de reproduceerbaarheid van de resultaten, is het wellicht mogelijk om het rendement te verhog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SFB1118). De auteurs bedank Axel Erhardt voor allermeest naar de dissectie uitvoeren en behulpzaam het overbrengen van deze kennis, en Dr. Volker Eckstein voor het assisteren in het technische aspect van de cytometer van de stroom.
Materials
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve – tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies?. Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -. M., Leong, A. S. -. Y. How does antigen retrieval work?. Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
