Analyse von Immunzellen in einzelnen Ischias Nerven und Dorsal Root Ganglion aus einem einzigen Mausklick mit Durchflusszytometrie

Summary

Quantitative Analyse des Zelleninhalts innerhalb der murinen Ischiasnerv wird erschwert durch die Knappheit des Gewebes. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Gewebe-Verdauung und Vorbereitung, die genügende Zellen für Flow-Zytometrie Analyse Immunzelle Populationen von Nerven der einzelnen Mäusen versorgt.

Abstract

Nerv-Resident Immunzellen in das periphere Nervensystem (PNS) sind wesentlich für neuronale Integrität in einen gesunden Nerv. Die Immunzellen des PNS betroffen sind Verletzungen und Erkrankungen, beeinträchtigen die Funktion der Nerven und die Fähigkeit zur Regeneration. Neuronale Zellen werden häufig durch Immunfluoreszenz (IF) analysiert. Während wenn ist wichtig für die Bestimmung des Orts der Immunzellen in den Nerv, wenn nur semi-quantitativen und die Methode beschränkt sich auf die Anzahl der Markierungen, die gleichzeitig analysiert werden können und der Grad der Oberflächenexpression. In dieser Studie wurde die Durchflusszytometrie für Quantitative Analyse der Leukozyten-Infiltration in Ischias Nerven oder Dorsal Root Ganglien (DRGs) von einzelnen Mäusen verwendet. Einzelne Zelle Analyse erfolgte mittels DAPI und mehrere Proteine gleichzeitig für die Oberfläche oder intrazelluläre Expression analysiert wurden. Beide Ischias Nerven von einer Maus, die nach diesem Protokoll behandelt wurden generiert ≥ 30.000 kernhaltigen Einzelveranstaltungen. Der Anteil der Leukozyten in den Ischias Nerven, bestimmt durch Expression von CD45, betrug etwa 5 % der gesamten Zellinhalt in den Ischiasnerv und etwa 5-10 % in der DRG. Obwohl dieses Protokoll konzentriert sich in erster Linie auf die Immunzelle Bevölkerung innerhalb der PNS, bedeutet die Flexibilität der Durchflusszytometrie, eine Reihe von Markierungen gleichzeitig messen, dass die anderen Zellen Populationen innerhalb der Nerven, wie Schwann-Zellen, Perizyten vorhanden , Fibroblasten und Endothelzellen, auch analysiert werden können mit dieser Methode. Diese Methode bietet daher ein neues Mittel für das Studium systemischer Wirkungen auf die PNS wie Neurotoxicology und genetische Modelle der Neuropathie oder bei chronischen Krankheiten wie Diabetes.

Introduction

Immunzellen, die aus dem Kreislauf der PNS eingeben helfen definiert durch den Ausdruck von CD45 und CD11b, um die Integrität des Nerven und eine Rolle sowohl in der Regeneration und Degeneration¹. Makrophagen (definiert durch ihren Ausdruck des CD68 Maus) können zu einer entzündlichen Phänotyp, mit dem Ausdruck mehr MHC verzerrt werden der Klasse II und CD86 auf ihrer Oberfläche (M1), oder gegen eine entzündungshemmende Phänotyp auszudrücken mehr intrazelluläre CD206 (M2)² . Schiefstellung des Phänotyps Makrophagen ist ein dynamischer Prozess durch Akt³-Signalisierung, reflektieren die verschiedenen Aufgaben der Makrophagen in der Abwehr von Krankheitserregern (M1) und die Rolle bei der Geweberegeneration (M2) geregelt. Regeneration von einem verletzten Nerven erfordert zunächst Phagozytose von Myelin Schutt durch Makrophagen in den Nerv^4,5, und entzündungshemmend (CD68⁺CD206⁺) M2-Makrophagen haben gezeigt, dass Axon Auswuchs in fördern die PNS-⁶. Reduzierte Rekrutierung oder Makrophagen an den PNS oder eingeschränkter Fähigkeit zur Phagozytose beeinträchtigt Regeneration und Pflege der Nerv Integrität führen kann. Entzündliche M1 Makrophagen, mit dem Ausdruck MHC Klasse II, sind weniger fähig als M2-Makrophagen Phagozytose und neuronaler Entzündung in der Pathogenese der verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten⁷verwickelt ist.

Die Änderungen, die an den Nerv resident Immunsystem als Folge von Schäden auftreten können quantitative, Verlust von CD45 manifestiert werden⁺ Leukozyten (oder Infiltration von CD45 erhöht⁺ Leukozyten im Fall Entzündungen), oder qualitative, wie z.B. Ändern von Makrophagen Phänotyp von M2, M1 Phänotyp. Die Immunzellen des PNS wurden traditionell durch IF, mit Gefrierschnitte oder Paraffin-eingebetteten materiellen⁸analysiert. IF ist für die Bestimmung der Lokalisierung der Zellen des Interesses erforderlich. Allerdings stützt sich Quantifizierung zu verwenden, wenn häufig auf zählen eine relativ kleine Anzahl von Zellen in einem schmalen Bereich des Gewebes, Quantifizierung unzuverlässig und Vorwählervorspannung anfällig machen. Für die Identifizierung von bestimmten Teilmengen von Immunzellen ist die simultane Detektion von extrazellulären und intrazellulären Markierungen erforderlich, während Bestimmung des Phänotyps Makrophagen mindestens mindestens zwei Markierungen, insbesondere CD206 und MHC erfordert Klasse II. Am häufigsten verfügbaren Mikroskope sind begrenzt auf mindestens zwei-Farben-Kanäle, wie Fluorescein erfolgt (FITC) und Phycoerythrin (PE), läßt die Charakterisierung der spezifischen Teilmengen von Immunzellen durch IF restriktiv und unvollständig, erfordern sich die Notwendigkeit, mehrere Folien, abgeleitet aus der gleichen Gegend von Interesse, die befleckt und parallel analysiert. Dieser zeitaufwändige Aspekt ist daher nicht notwendig, eignet sich zur Analyse der großen Sample-Sets. Da die meisten der Marker des Interesses extrazelluläre kann der Nachweis im Gewebe, die entweder in Paraffin oder kryokonservierten eingebettet worden, problematisch wegen der Störung der Membran Integrität und die Maskierung von Epitopen sowie den Verlust von werden die Antigene des Interesses durch die Verwendung von Lösungsmitteln wie Aceton und Methanol⁹.

Im Gegensatz dazu flow Cytometry, welche optische Maßnahmen und Fluoreszenz Eigenschaften einzelner Zellen in Suspension als Durchgang durch einen Lichtstrahl, bietet praktische und umfassende Analyse der Zell-Populationen. Durchflusszytometrie, anstatt zu produzieren ein digitales Bild des Gewebes, bietet eine automatisierte Quantifizierung der eingestellten Parameter, die relative Größe und reflektierende Index, genannt der forward Scatter (FSC), Granularität/interne Komplexität der Zelle enthalten oder Seite-Streuung (SSC) und relativen Fluoreszenzintensität, vorausgesetzt, dass die Zelle mit einer entsprechenden Fluorophor wie ein konjugierten Antikörper gekennzeichnet hat. Eine typische Durchflusszytometer besteht aus zwei, luftgekühlte Laser; ein Argonlaser erzeugt Blaulicht bei 488 nm und einem Helium-Neon-Laser erzeugt Licht bei 633 nm. Diese Kombination ermöglicht die Erkennung und Messung, gleichzeitig mindestens fünf Ziele auf der Oberfläche oder in den intrazellulären Raum. Erweiterte fließen Cytometers besteht aus mehreren Lasern, die für die Erkennung von bis zu acht verschiedene Fluorochromes auf einmal erlauben, dass Emissionen Spitzenwellenlängen von ausgewählten Fluorochromes nicht erheblich überschneiden.

Für die Analyse von Durchflusszytometrie, muss das Gewebe von Interesse zuerst enzymatisch, in der Regel mit Kollagenase, eine einzellige Suspension erzeugen verdaut werden. Die Analyse der murinen Ischias Nerven war bisher schwierig aufgrund der geringen Menge des Gewebes aus jeder Maus gewonnen. Darüber hinaus der hohe Fettgehalt von Myelin um die Axone behindert Zelle Erholung und produziert große Mengen von Schutt. Für die Vorbereitung der Ischiasnerv und Verdauung hierin beschriebene Methode wurde von Schwann-Zellen isoliert Protokoll der Spange Et al. ⁷, und zielt darauf ab, genügend Zellen von Nerven der einzelnen Mäuse für Flow-Zytometrie-Analyse, zu isolieren, um Unterschiede zwischen den Mäusen zu reduzieren. Mit DAPI für die Identifizierung von einzelnen Zellen in der rohen Gewebe Digest umgeht die Notwendigkeit, Axon Schmutz, die häufig zum Verlust der Zelle führt. Waschen, mehrmals mit einer Waschmittel-reiche Puffer Aids in der Freisetzung von Zellen gefangen in fetthaltigen Schmutz, dadurch Erhöhung der Ausbeute. Verdauung der beiden Full-length Ischias Nerven von einem einzigen Mausklick nach diesem Protokoll generiert ≥30, 000 kernhaltigen Einzelveranstaltungen und mindestens 3 mal so viele von der DRG abgerufen wurde. Der Anteil der CD45⁺ Leukozyten lag bei ca. 5 % der gesamten Zellinhalt in der Ischiasnerv Digest und etwa von 5-10 % in der DRG-Digest. Der Großteil der CD45⁺ Zellen in den Ischiasnerv drückte die Makrophagen Marker, CD68 und CD206.

Protocol

Wildtyp C57BL/6 Mäusen (Männchen; 10-12 Wochen) wurden in standard 12 h hell/dunkel-Zyklus gehalten und wurden standard Chow Ernährung und Wasser kostenfrei zur Verfügung gestellt. Alle Tierversuche wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den einschlägigen Leitlinien der lokalen Animal Care und Einsatz hat und durch die lokalen Animal Care and Use Committee bei der regionalen Behörde in Karlsruhe, Deutschland (G216/10) genehmigt. (1) Perfusion der Maus Opfer der Maus (C57B…

Representative Results

Zellsuspensionen von Full-length Ischias Nerven und allen wichtigen DRG waren vorbereitet, nach dem Protokoll von sechs gesunde C57BL/6 Mäusen und unterteilt in drei gleiche Aliquote zum Färben. Zähler mit DAPI, die DNA zu Flecken, beflecken erlaubt die Erkennung einer einzelnen Zelle Bevölkerung (Abbildung 1A–B, obere Leiste). Auswaschen DAPI, vor der Analyse von Durchflusszytometrie, sank in einem Ausmaß die fluoresz…

Discussion

Ischias Nerven enthalten einen großen Anteil an Lipiden, wie Cholesterin, aufgrund des Gehaltes an Myelin um die Axone. Da die Eigenschaften von Lipiden mit Temperatur ändern, erhalten Sie unterschiedliche Ergebnisse bei unterschiedlichen Temperaturen. Um die Zelle Erhaltung zu gewährleisten, wurden alle Schritte in diesem Protokoll nach der Verdauung auf Eis durchgeführt. Während Konsistenz aus Gründen der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse empfohlen wird, kann Ausbeute zu erhöhen, durch Ausführen der Schritte 3….

Materials

C57BL/6 Mouse	Charles River	C57BL/6NCrl
DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate)	Thermo	31885023	The source of this material is not important
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Collagenase Type 4	Worthington Biochemical Corp., US	LS004188
Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I	Sigma-Aldrich	DN25-1g
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated	Sigma-Aldrich	F4135
Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5	Biolegend	101228	Clone M1/70
Antibody against MHC class II, biotinylated	Biolegend	107603	Clone M5/114.15.2
Antibody against CD45-A647	Biolegend	107603	Clone 30-F11
Antibody against CD68-APC	Biolegend	137007	Clone FA/11
Antibody against CD206-PE	Biolegend	141706	Clone C068C2
Antibody against F4/80-PE/Cy7	Biolegend	123113	Clone BM8
Streptavidin-PE/Cy7	Biolegend	405206	Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5
Streptavidin-PerCP	Biolegend	405213	Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark
Cell dissociation sieve – tissue grinder kit	Sigma-Aldrich	CD1
V-Shaped, 96-well plates	Greiner/Sigma	M8185
5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm	BD Biosciences	352008
60x15mm petri dish	Greiner/Sigma	Z643084
BD LSR II Flow Cytometer	BD Biosciences