단일 좌 골 신경 및 Cytometry 사용 하 여 단일 마우스에서 지 루트 신경 절에 면역 세포의 분석
Summary
정량 분석 murine 좌 골 신경 내에서 셀 내용의 조직의 부족으로 인해 어렵습니다. 이 프로토콜 조직 소화와 개별 쥐의 신경에서 면역 세포 인구의 흐름 cytometry 분석에 대 한 충분 한 세포를 제공 하는 준비 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
말 초 신 경계 (PNS) 신경 상주 면역 세포는 건강 한 신경에 신경 원 완전성을 유지 하기 위해 필수적입니다. PNS의 면역 세포는 상해 및 질병, 신경 기능 재생 능력에 영향을 미치는 영향을. 신경 면역 세포 면역 형광 검사 (면)에 의해 일반적으로 분석 된다. 경우 경우 신경에 면역 세포의 위치를 결정 하기 위한 에센셜만 반 정량적 이며 방법은 동시에 분석할 수 있는 마커 수와 표면 식의도로 제한 하는 동안. 이 연구에서 cytometry 좌 골 신경이 나 개별 쥐의 지 루트 절 (Drg)에 백혈구 침투의 정량 분석을 위해 사용 되었다. 단일 세포 분석 DAPI를 사용 하 여 수행 하 고 여러 가지 단백질 동시에 표면 또는 세포내 식에 대 한 분석 했다. 이 프로토콜에 따라 치료 한 마우스에서 두 좌 골 신경 ≥ 30000 단일 nucleated 이벤트 생성. 좌 골 신경, CD45의 식에 의해 결정에 백혈구의 비율이 전체 셀 내용 좌 골 신경에서의 5%와 대략 5-10%는 DRG에 약 했다. 하지만이 프로토콜 PNS 내 면역 세포 인구에 주로 초점을 맞추고, cytometry 마커 수를 동시에 측정 하의 유연성 즉 신경, Schwann 세포, pericytes 등 내의 다른 세포 인구 섬유 아 세포와 내 피 세포, 또한 분석 될 수 있다이 방법을 사용 하 여. 따라서이 메서드는 PNS, neurotoxicology 등 신경 병 또는 당뇨병 같은 만성 질환에서 유전자 모델에 조직의 효과 공부에 대 한 새로운 의미를 제공 합니다.
Introduction
면역 세포는 순환에서 PNS를 입력 CD45 그리고 CD11b의 식에 의해 정의 된 대로 재생 및 변성1에서 두 역할을 신경의 무결성을 유지 도움이. 대 식 세포 (그들의 표현의 CD68 마우스에 의해 정의 된) 더 MHC를 표현 하는 염증 성 표현 형을 향해 왜곡 수 있습니다 클래스 II 및 CD86 (M1), 그들의 표면에 또는 항 염증 제 표현 형으로 표현 더 많은 세포내 CD206 (M2)2 . 대 식 세포 표현 형의 기울이기 Akt 신호3, 반사 체 (M1)에 대 한 방어에 대 식 세포 및 조직 재생 (M2)에서 역할의 다양 한 작업을 통해 규제 하는 역동적인 과정 이다. 손상 된 신경의 재생 먼저 신경4,5, 및 항 염증 세포 myelin 파편 식 균 작용 해야 (CD68+CD206+) M2 세포 축 삭 파생물에 홍보 보였다는 PNS6. PNS, 채용 또는 대 식 세포 감소 또는 먹어서 장애인된 능력 장애인된 재생 및 신경 무결성의 유지 관리 될 수 있습니다. 염증 성 m 1 대 식 세포, MHC 종류 II, 표현 M2 세포 보다 덜 먹어서 수 있으며 신경 염증은 여러 가지 신경 퇴행 성 질병7의 병 인에 연루.
신경 거주 면역 체계 손상 때문에 발생 하는 변화는 양적, CD45의 손실에 명시 수 있습니다+ 백혈구 (CD45의 침투를 증가 또는+ 경우 염증에 백혈구), 또는과 같은 질적 m 1 형 m 2에서 대 식 세포 표현 형의를 변경 합니다. PNS의 면역 세포는 전통적으로 냉동된 섹션 또는 파라핀 끼워 넣어진 소재8를 사용 하 여 IF를 사용 하 여 분석 되었습니다. 만약 관심의 세포의 지역화를 결정 하는 데 필요한. 그러나, 부 량 사용 하는 경우 종종 불안정 하 고 취약 선택 바이어스에 정량화를 만드는 조직의 좁은 부분에 셀의 상대적으로 작은 수를 계산에 의존 합니다. 면역 세포의 특정 하위 집합의 식별을 위해 세포 외 또는 세포내 표식의 동시 검출이 필요, 대 식 세포 표현 형의 결정은 적어도 두 개 이상 표시, 특히 CD206와 MHC를 필요 합니다 하는 동안 클래스 Ii입니다. 가장 일반적으로 사용 가능한 현미경 fluorescein isothiocyanate (FITC) 등 phycoerythrin (PE), 적어도 2 색상 채널에 제한 됩니다 경우 면역 세포의 특정 하위 집합의 특성 수 제한 하 고, 불완전 한 요구 얼룩이 고 병렬로 분석 필요 여러 슬라이드는 동일한 지역에서 파생. 이 시간이 많이 걸리는 측면은 따라서 하지 않습니다 필요한 큰 샘플 세트의 분석에 빌려. 또한, 관심의 표시의 대부분은 세포 외, 중 파라핀 또는 cryoconserved에 포함 되어, 조직에서 검출 수 막 무결성의 파괴와 epitopes, 마스킹의 손실 때문에 문제 아세톤과 메탄올9같은 용 매를 사용 하 여 관심의 항 원.
대조적으로, cytometry, 광학 측정 흐름 고 형광 특성에에서 단일 셀의 빛의 광선을 통과 제공 합니다 셀 인구의 분석을 위해 더 실용적이 고 포괄적인 의미. 셀의 상대적인 크기와 앞으로 분산형 (FSC), 복잡 한 단위/내부로 반사 인덱스를 포함 하는 매개 변수 설정된의 자동화 된 정량화를 제공 하는 조직의 디지털 이미지를 생산 하는 것 보다는 cytometry, 또는 측면 살포 (SSC), 그리고 상대 형광 강도 제공 하는 셀 활용 된 항 체와 같은 적절 한 fluorophore와 분류 되었습니다. 전형적인 교류 cytometer 이루어져 있다 2, 공 냉 식된 레이저; 488에서 푸른 빛을 생산 하는 아르곤 레이저 및 헬륨-네온 레이저 생산 633에 빛 nm. 이 조합은 최소 5 목표 표면에 또는 세포내 구획 내에서 동시에, 탐지 및 측정, 대 한 수 있습니다. 고급 흐름 cytometers 허용 한 번에 최대 8 개의 다른 형광의 탐지를 위해 선택 된 형광의 피크 방출 파장 크게 중복 되지 않도록 제공 하는 여러 레이저 구성할 수 있습니다.
Cytometry 분석, 대 한 관심의 조직 해야 합니다 먼저 수 효소 소화, 일반적으로 단일 세포 현 탁 액을 생성 하기 위해 콜라와 함께. 분석 murine 좌 골 신경의 이전 조직의 각 마우스에서 얻은 작은 금액으로 인해 어려운 되었습니다. 또한, 축 삭 주위 myelin의 고 지방 내용 셀 복구를 저해 하며 많은 양의 파편을 생성 합니다. 좌 골 신경 준비 및 소화에 대 한 여기에 설명 된 메서드 외. 여 자용 머리 핀 Schwann 세포 격리 프로토콜에서 적응 시켰다 7, 그리고 쥐 간의 편차를 줄이기 위해 충분 한 흐름 cytometry 분석에 대 한 개별 쥐의 신경 세포를 분리 하는 것을 목표로. DAPI를 사용 하 여 원시 조직 다이제스트에서 단일 세포의 식별에 대 한 축 삭 파편, 일반적으로 셀 손실에 이르게 제거할 필요가 circumvents. 셀의 출시에 세제-풍부한 버퍼 에이즈로 여러 번 세척 수확량 증가 지방 파편 안에서 갇혀. 이 프로토콜에 따라 단일 마우스에서 두 길이 좌 골 신경의 소화 ≥30, 000 단일 nucleated 이벤트를 생성 하 고 3 배 이상 그 숫자는 DRG에서 검색. CD45 비율+ 백혈구는 총 셀 내용 좌 골 신경 다이제스트 및 약의 약 5% DRG 다이제스트에서 5-10%. 대부분은 CD45의+ 좌 골 신경에 있는 세포 대 식 세포 마커, CD68 및 CD206을 표현.
Protocol
Representative Results
Discussion
좌 골 신경 축 삭 주위 myelin의 콘텐츠로 인해 콜레스테롤 같은 지질의 큰 비율을 포함합니다. 온도와 지질의 속성 변경, 다른 온도에 다른 결과 얻을 수 있습니다. 셀 보존 되도록 소화 후이 프로토콜의 모든 단계는 얼음에 수행 했다. 일관성 결과의 재현성을 위해서 권장 하는 동안 그것은 3.6, 3.7 실 온에서 단계를 수행 하 여 수율을 높일 수 수 있습니다. 3.8 단계에서 신경 충분히 소화 하지 해야 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 도이치 가운데 (DFG;에 의해 지원 되었다 SFB1118)입니다. 저자는 해 부의 대부분을 수행 하 고 유익 하 게이 지식을 전송에 대 한 악 셀 Erhardt와 박사 Volker 엑스 타인과 교류 cytometer의 기술적인 측면에 도움을 위한 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve – tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
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