Analyse des cellules immunitaires dans unique des nerfs sciatique et Ganglion de la racine dorsale d’une souris à l’aide de cytométrie en flux
Summary
Analyse quantitative du contenu de la cellule dans le nerf sciatique murin est difficile en raison de la rareté du tissu. Ce protocole décrit une méthode de digestion de tissu et de préparation qui fournit des cellules suffisants pour analyse en cytométrie flux de populations de cellules immunitaires des nerfs de souris individuels.
Abstract
Nerf-résident des cellules immunitaires dans le système nerveux périphérique (PNS) sont essentiels pour préserver l’intégrité neuronale dans un nerf sain. Les cellules immunitaires de la PNS sont touchés par des blessures et la maladie, qui affecte la fonction nerveuse et la capacité de régénération. Les cellules immunitaires neuronales sont couramment analysés par immunofluorescence (IF). Tandis que si est essentielle pour déterminer l’emplacement des cellules immunitaires dans le nerf, s’il est seulement semi-quantitative et la méthode est limitée au nombre de marqueurs qui peuvent être analysés simultanément et le degré d’expression à la surface. Dans cette étude, cytométrie en flux a été utilisée pour l’analyse quantitative de l’infiltration leucocytaire dans les nerfs sciatiques ou des ganglions de la racine dorsale (DRGs) de souris individuels. Analyse d’unicellulaire a été réalisée à l’aide de DAPI et plusieurs protéines ont été analysés en même temps pour l’expression de surface ou intracellulaire. Les deux nerfs sciatiques d’une souris qui ont été traitées selon ce protocole générée ≥ 30 000 unique nucléées des événements. Les leucocytes dans les nerfs sciatiques, déterminés par l’expression de CD45, représentaient environ 5 % du contenu total de cellules dans le nerf sciatique et environ 5 à 10 % dans le PMSI. Bien que ce protocole se concentre principalement sur la population de cellules immunitaires dans le PNS, la flexibilité de la cytométrie pour mesurer un certain nombre de marqueurs simultanément signifie que les autres populations de cellules présentes dans le nerf, telles que les cellules de Schwann, péricytes , les fibroblastes et les cellules endothéliales, peuvent être également analysées à l’aide de cette méthode. Cette méthode offre donc un nouveau moyen pour étudier les effets systémiques sur le PNS, comme neurotoxicologie et modèles génétiques de neuropathie ou des maladies chroniques, telles que le diabète.
Introduction
Les cellules immunitaires qui entrent le PNS de la circulation, tel que défini par l’expression de CD45 et CD11b, aident à maintenir l’intégrité du nerf et jouent un rôle tant dans la régénération et la dégénérescence1. Macrophages (définis par leur expression du CD68 chez la souris) peuvent être décalés vers un phénotype inflammatoire, exprimant plus MHC de classe II et CD86 sur leur surface (M1), ou vers un phénotype anti-inflammatoires, exprimant plus CD206 intracellulaire (M2)2 . L’inclinaison du phénotype macrophage est un processus dynamique réglementé par Akt signalisation3, reflétant les différentes tâches des macrophages dans la défense contre les agents pathogènes (M1) et le rôle dans la régénération des tissus (M2). Régénération d’un nerf lésé exige d’abord la phagocytose des débris de la myéline par des macrophages dans le nerf4,5et anti-inflammatoire (CD68+CD206+) auraient dû être divulgués M2 macrophages pour promouvoir l’excroissance des axones dans le PNS6. Réduit de recrutement ou macrophages à la PNS, ou capacité altérée de phagocytose altérée de régénération et de maintien de l’intégrité du nerf peut entraîner. Inflammatoires M1 macrophages, exprimant le CMH de classe II, sont moins capables de phagocytose que M2 macrophages et inflammation neuronale est impliquée dans la pathogénie de plusieurs de maladies neurodégénératives7.
Les changements qui se produisent au système immunitaire résident nerveuses par suite de dommages peuvent être quantitatives, qui manifeste une perte de CD45+ leucocytes (ou augmenté l’infiltration du CD45+ leucocytes dans l’affaire inflammation), ou qualitatifs, tels que changer de phénotype macrophage de M2 à M1 phénotype. Les cellules immunitaires de la PNS ont traditionnellement été analysées au moyen de l’IF, à l’aide de coupes congelées ou paraffine matériel8. IF est nécessaire pour déterminer la localisation des cellules d’intérêt. Cependant, quantification si souvent repose sur le comptage un relativement petit nombre de cellules dans une partie étroite du tissu, faire quantification fiable et vulnérables à des biais de sélection. Pour l’identification des sous-ensembles spécifiques de cellules immunitaires, la détection simultanée des marqueurs extracellulaires ou intracellulaires est requise, tandis que la détermination du phénotype macrophage nécessite au moins au moins deux marqueurs, en particulier CD206 et MHC classe II. Comme plus couramment microscopes disponibles sont limités au moins deux couleurs canaux, tels que l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et la phycoérythrine (PE), la caractérisation des sous-ensembles spécifiques de cellules immunitaires par IF peut être restrictive et incomplète, nécessitant la nécessité de disposer de plusieurs diapositives, dérivé de la même zone d’intérêt, qui sont colorées et analysés en parallèle. Cet aspect fastidieux n’est donc pas nécessaire se prête à l’analyse des ensembles de grands échantillons. En outre, comme la plupart des marqueurs d’intérêt extracellulaire, la détection dans le tissu, qui a été soit intégrée dans la paraffine ou frais, peut être problématique en raison de la rupture de l’intégrité membranaire et le masquage des épitopes, ainsi que la perte de les antigènes de l’intérêt de l’utilisation de solvants comme l’acétone et le méthanol9.
En revanche, cytométrie en flux, qui mesure optique et caractéristiques de la fluorescence des cellules individuelles en suspension pendant qu’ils traversent un faisceau de lumière, offre un moyen plus pratique et complet pour l’analyse des populations cellulaires. Cytométrie en flux, plutôt que de produire une image numérique du tissu, fournit une quantification automatique des paramètres définis, qui comprennent une cellule taille relative et indice de réflexion, dénommé le forward scatter (FSC), complexité granularité/interne ou diffusion latérale (SSC) et l’intensité de la fluorescence relative, fournissant que la cellule a été étiquetée avec un fluorophore approprié, comme un anticorps conjugué. Un cytomètre en flux typique se compose de deux, lasers refroidis à l’air ; un laser à argon produit une lumière bleue à 488 nm et un laser hélium-néon émet des rayons à 633 nm. Cette combinaison permet de détection et de mesure, simultanément, d’au moins cinq cibles sur la surface ou dans le compartiment intracellulaire. Plus avancés cytomètres peut se composer de plusieurs lasers, qui permettant de détecter des fluorochromes différents jusqu’à huit en même temps, fournissant que les longueurs d’onde d’émission de pic des fluorochromes sélectionnés ne se chevauchent pas significativement.
Pour l’analyse par cytométrie en flux, le tissu d’intérêt doit d’abord être enzymatiquement digéré, généralement avec la collagénase, pour générer une suspension monocellulaire. L’analyse de la murines nerfs sciatiques a été difficile en raison de la petite quantité de tissu provenant de chacune des souris. En outre, la haute teneur en matières grasses de la myéline autour des axones entrave la récupération de la cellule et produit de grandes quantités de débris. La méthode décrite ici pour la digestion et préparation du nerf sciatique est une adaptation de la cellule de Schwann protocole d’isolement de Barrette et al. 7et vise à isoler suffisamment de cellules des nerfs des souris individuels pour analyse en cytométrie en flux, afin de réduire la variation entre les souris. À l’aide de DAPI pour l’identification des cellules individuelles dans le digest de tissus bruts contourne la nécessité d’éliminer les débris d’axon, qui entraîne généralement la perte de cellules. Laver plusieurs fois avec un sida détergent riche tampon dans la libération des cellules emprisonnées dans les débris de gras, ce qui augmente le rendement. Digestion des deux nerfs sciatiques pleine longueur d’une seule souris selon ce protocole génère ≥ 30, 000 événements nucléées uniques et au moins 3 fois ce nombre a été récupéré de la DRG. La proportion de CD45+ leucocytes était d’environ 5 % du contenu total de cellules dans le digest de nerf sciatique et environ 5-10 % dans le digest DRG. La majorité de la CD45+ cellules dans le nerf sciatique expriment les marqueurs de macrophage, CD68 et CD206.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nerfs sciatiques contiennent une proportion importante des lipides, comme le cholestérol, en raison du contenu de la myéline autour des axones. Étant donné que les propriétés des lipides changent avec la température, les différents résultats peuvent être obtenus à différentes températures. Afin d’assurer la préservation de la cellule, toutes les étapes dans ce protocole après la digestion ont été effectuées sur la glace. Alors que la cohérence est recommandé pour des raisons de reproductibilité de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ; SFB1118). Les auteurs aimeraient remercier Axel Erhardt pour effectuer la plupart de la dissection et utilement transmettre ces connaissances et Dr. Volker Eckstein devant concourir à l’aspect technique de la cytomètre de flux.
Materials
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve – tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies?. Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -. M., Leong, A. S. -. Y. How does antigen retrieval work?. Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
