単一の坐骨神経とフローサイトメトリーを使用して単一のマウスの後根神経節における免疫系細胞の解析
Summary
マウスの坐骨神経内のセルのコンテンツの定量的解析は組織の欠乏のために困難です。このプロトコルでは、組織の消化と個々 のマウスの神経から免疫細胞のフローサイトメトリー解析のため十分な細胞を提供する準備のためのメソッドについて説明します。
Abstract
末梢神経系 (PNS) で神経居住者免疫細胞が正常な神経で神経細胞の整合性を維持するため不可欠です。PNS の免疫細胞は怪我と病気、神経機能と再生能力に影響を受けます。神経免疫細胞は、蛍光抗体法 (IF) によって分析される一般的。一方、神経の免疫細胞の場所を決定する場合に不可欠な半定量的なだけあり、メソッドが同時に分析することができるマーカーの数および発現の程度に限定。この研究では、cytometry 流れは坐骨神経や個々 のマウスの後根罹 (Drg) に白血球浸潤の定量的解析に使われました。DAPI を使用して単一細胞分析を行った、いくつかのタンパク質は表面または細胞内のいずれかの式を同時に行った。このプロトコルに従って扱われた 1 つのマウスからの両方の坐骨神経には、≥ 30,000 単一核イベントが生成されます。坐骨神経の全セルの内容の 5%、DRG の約 5-10%、CD45 の表現によって決定される坐骨神経の白血球の割合は約だった。フローサイトメトリー マーカーの数を同時に測定するための柔軟性は、シュワン細胞、血管など、神経の中に存在他の細胞集団が、このプロトコルは PNS 内免疫細胞の人口に主に焦点を当てて、します。、、線維芽細胞と血管内皮細胞も分析できますこのメソッドを使用します。このメソッドは、したがって全身に及ぼす神経毒性学など神経障害や糖尿病などの慢性疾患の遺伝学的モデル、PNS の勉強の新しい手段を提供します。
Introduction
免疫細胞、循環から PNS を入力する CD45 と CD11b、式によって定義されている神経の整合性を維持し、再生と変性の1の両方の役割を果たすに役立ちます。大食細胞 (マウス CD68 の発現によって定義された) より MHC の発現、炎症性表現型に向かって傾斜することができますクラス II および CD86 (M1)、表面にまたは抗炎症表現に向かってより多くの細胞内の CD206 を表現する (M2)2.大食細胞の表現型の傾斜は、動的なプロセスを通して Akt シグナル3、(M1) 病原体に対する防御の大食細胞と組織再生 (M2) の役割のさまざまなタスクを反映した規制です。損傷した神経の再生は最初神経4、5、および抗炎症におけるマクロファージによって髄鞘の残骸の貪食能を必要とする (CD68+CD206+) M2 マクロファージにおける軸索伸長を促進するために示されている、PNS6。募集または大食細胞を抑える、PNS や貪食障害能力障害再生と神経の恒常性を維持。MHC クラス II を表現する炎症性の M1 マクロファージは M2 マクロファージの貪食性ほどの能力であり、神経の炎症、いくつか神経変性疾患7の病因に関与しています。
神経住民免疫系の損傷の結果として発生する変更は定量的、CD45 の損失けんしょう、+白血球 (CD45 の浸潤を増加または+ケースの炎症で白血球)、や定性的なようM2 から M1 型マクロファージ表現型の変更します。PNS の免疫細胞は、凍結切片またはパラフィン包埋材料8を使用して場合によって伝統的に分析されています。もし興味のセルの局在を決定するために必要です。ただし、多くの場合数量を使用して信頼性と選択バイアスに対する脆弱性定量化を作る組織の狭いセクションのセルの比較的小さい数を数えてに依存します。大食細胞の表現型の定量が必要です少なくとも少なくとも 2 つのマーカー、特に CD206 と MHC ながら免疫細胞の特定のサブセットの識別のため細胞外および細胞内のマーカーの同時検出が必要です、クラス II です。場合によって免疫細胞の特定のサブセットの特性が制限し、不完全な要求をすることができます最もよく利用できる顕微鏡は少なくとも 2 色チャネル、かに (FITC)、フィコエ リスリン (PE) などに限られています。複数のスライドを持つ必要性は、染色し、並行分析関心の同じ領域から派生します。したがってこの時間がかかるのしない必要が大規模なサンプル セットの分析にそれ自身を貸します。さらに、興味のマーカーのほとんどが細胞外、パラフィンまたは cryoconserved にも埋め込まれています、組織で検出は膜の完全性の破壊とエピトープのマスキングと同様の損失のため問題が発生することができます。アセトン ・ メタノール9などの溶剤の使用からの興味の抗原。
対照的に、フローサイトメトリー、光を測定して単一細胞懸濁液中の蛍光特性、光のビームを通過する細胞集団の解析のためのより実用的で包括的な手段を提供します。組織のデジタル画像を生成するのではなく、フローサイトメトリー、セルの相対的なサイズおよび前方散乱 (FSC)、粒度/内部の複雑さと呼ばれる反射のインデックスを含めるパラメーターの設定の自動定量評価を提供していますか側方散乱 (SSC) と相対蛍光強度、セルは、共役抗体などの適切な蛍光でラベル付けされていますを提供します。典型的な流れの cytometer から成っている 2 つ、空冷レーザー;アルゴン レーザーは 488 で青い光を作り出す nm とヘリウム ネオン レーザーは 633 で光を生成する nm。この組み合わせは表面や細胞内コンパートメント内の少なくとも 5 つの目標の同時に、により検出と測定。高度な流れの cytometers は選択した螢のピーク発光波長が大きく重複しないを提供すること、一度に最大 8 つの異なる蛍光色素の検出を可能にする複数のレーザーで構成できます。
フローサイトメトリーによる解析、興味の組織する必要があります最初酵素によって消化される一般的にはコラゲナーゼ、単一細胞懸濁液を生成します。以前のマウスの坐骨神経の解析は、各マウスから得られた組織量が少ないため、難しかったです。さらに、軸索を髄鞘の高脂肪の内容細胞回復を阻害して大量の破片が生成されます。坐骨神経の準備と消化のためにここに記載されているメソッドは、バレッタらのシュワン細胞の隔離のプロトコルから適応されました。7、およびマウスの間の変動を減らすために十分な流れフローサイトメトリー解析のための個々 のマウスの神経細胞を分離することを目的。生組織ダイジェストで単一のセルの識別の DAPI を使用してよくセル損失につながる軸索の残骸を削除する必要性を回避できます。収量を増加脂肪の残骸内細胞のリリースで洗剤の豊富なバッファー エイズで数回洗浄に閉じ込められました。このプロトコルに従って単一のマウスから両方のフルレングスの坐骨神経の消化が ≥30、000 の単一核イベントを生成し、少なくとも 3 倍の数は、DRG から取得されました。CD45 の割合+白血球坐骨神経ダイジェスト約の合計セル コンテンツの約 5% であったDRG ダイジェストの 5-10%。CD45 の大半+坐骨神経細胞大食細胞マーカー、CD68 と CD206 を表明しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
坐骨神経には、軸索の周りのミエリンのコンテンツのためのコレステロールなどの脂質の大部分が含まれています。以来、脂質の特性は温度によって変化、異なる温度で異なる結果を得られるかもしれない。、細胞を保護するには、氷の上消化後このプロトコルのすべてのステップを行った。結果の再現性のために、整合性を推奨しながら 3.6、3.7 室温での手順を実行して歩留まりを増加す?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、ドイツ研究振興協会 (DFG; によって支えられました。SFB1118)。著者は、解剖のほとんどを実行し、親切この知識を送信するためのアクセル エアハルトと流れの cytometer の技術的な面で支援するため博士フォルカー ・ エクスタインに感謝したいと思います。
Materials
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve – tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
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