应用流式细胞仪分析单侧坐骨神经和背根神经节的免疫细胞
Summary
由于组织的缺乏, 小鼠坐骨神经内细胞含量的定量分析是困难的。本协议描述了一种组织消化和制备的方法, 它提供了足够的细胞, 用于对单个小鼠神经的免疫细胞进行流式细胞仪分析。
Abstract
神经驻留免疫细胞在周围神经系统 (三七) 是必不可少的保持神经元完整的健康神经。三七总皂苷的免疫细胞受损伤和疾病的影响, 影响神经功能和再生能力。神经免疫细胞通常通过免疫荧光 (如果) 进行分析。如果是确定神经的免疫细胞位置的必要条件, 如果只是半定量的, 并且方法仅限于可以同时分析的标记的数量和表面表达的程度。本研究采用流式细胞术对单个小鼠坐骨神经或背根节 (DRGs) 的白细胞浸润进行定量分析。用 DAPI 进行单细胞分析, 同时分析了几种蛋白质的表面或细胞内表达。根据本议定书处理的一只老鼠的坐骨神经都产生了≥3万单核事件。坐骨神经中白细胞的比例由 CD45 表达, 在坐骨神经中的总细胞含量约为 5%, 在根节中约5-10%。虽然本协议主要关注的是在三七总皂苷内的免疫细胞, 但流式细胞仪的灵活性, 同时测量一些标记, 意味着其他细胞存在于神经, 如雪旺细胞, 周、成纤维细胞和内皮细胞膜, 也可以用这种方法进行分析。因此, 该方法为研究三七总皂甙的系统性影响提供了新的途径, 如神经病变的毒和遗传模型, 以及糖尿病等慢性病。
Introduction
从循环中进入三七总皂苷的免疫细胞, 如 CD45 和 CD11b 的表达, 有助于维持神经的完整性, 并在再生和变性方面发挥作用1。巨噬细胞 (由它们的 CD68 在老鼠中的表达) 可以偏向于炎症表型, 表达更多的 MHC 类 II 和 CD86 在他们的表面 (M1), 或对抗炎表型, 表达更多的胞内 CD206 (M2)2.巨噬细胞表型的倾斜是通过 Akt 信号3调节的动态过程, 反映了巨噬细胞在防御病原体 (M1) 和组织再生中的作用 (M2) 的不同任务。损伤的神经的再生首先要求吞噬髓鞘残骸由巨噬细胞在神经4,5和抗炎性 (CD68+CD206+) M2 巨噬细胞被证明促进轴突生长在6。减少招募或巨噬细胞的总皂苷, 或受损能力的吞噬可能导致受损的再生和维持神经完整性。炎症 M1 巨噬细胞, 表达 MHC 类 II, 是较少的能力吞噬比 M2 巨噬细胞, 和神经元炎症牵连的发病机制的几个神经退行性疾病7。
由于损伤引起的神经居民免疫系统的变化可能是定量的, 表现在失去 CD45 的+白细胞 (或增加渗透的 CD45+白细胞的情况下炎症), 或定性, 如巨噬细胞表型从 M2 到 M1 表型的变化。通过使用冰冻切片或石蜡嵌入材料8, 对三七总皂苷的免疫细胞进行了传统的分析。如果需要确定感兴趣的细胞的定位。然而, 定量使用如果经常依靠计数少量细胞在一个狭窄的部分组织, 使定量不可靠和易受选择偏倚。为了识别特定的免疫细胞子集, 同时检测细胞外和/或细胞内标记是必需的, 而巨噬细胞表型的确定至少需要两个标记, 特别是 CD206 和 MHC类 II。由于大多数常用的显微镜都被限制在至少两色的通道, 如荧光素异硫氰酸酯 (FITC) 和藻 (PE), 对免疫细胞的特定子集的表征, 如果可以是限制性和不完整的, 需要需要有多个幻灯片, 从相同的兴趣领域, 这是染色和分析并行。因此这费时的方面不必要借自己对大样品集合的分析。此外, 由于大部分的兴趣标记都是胞外的, 所以在组织中的检测, 或者被植入石蜡或 cryoconserved, 由于细胞膜完整性的破坏和表位的掩蔽, 以及失去由使用溶剂引起的抗原, 如丙酮和甲醇9。
相比之式细胞仪 , 它测量单细胞的光学和荧光特性的悬浮 , 因为他们通过一束光 , 提供了一个更实用和全面的方法来分析细胞的数量。流式细胞术, 而不是制作一个数字图像的组织, 提供了一个自动量化的设置参数, 其中包括一个细胞的相对大小和反射指数, 称为前散射 (FSC), 粒度/内部复杂度或侧散射 (SSC) 和相对荧光强度, 提供该细胞已被标记为适当的荧光, 如共轭抗体。典型的流式细胞仪由两个空冷激光器组成;氩激光在 488 nm 处产生蓝光, 氦氖激光器在 633 nm 产生光。这一组合允许检测和测量, 同时, 至少五目标, 无论是在表面上或在细胞内室。更先进的流 cytometers 可以由多个激光器组成, 它允许一次检测多达八种不同的荧光, 这就使得所选荧光的峰值发射波长不会有明显的重叠。
通过流式细胞仪分析, 首先要酶消化, 一般用胶原酶, 产生单细胞悬浮。小鼠坐骨神经的分析以前是困难的, 因为少量的组织从每只老鼠获得。此外, 高脂肪含量的髓鞘周围的轴突阻碍细胞的恢复和产生大量的碎片。本文对坐骨神经的制备和消化的方法进行了改编, 从发夹的雪旺细胞隔离协议的et al.7, 目的是从单个小鼠的神经中分离出足够的细胞进行流式细胞仪分析, 以减少小鼠之间的变异。在原始组织文摘中使用 DAPI 来识别单个细胞, 绕过需要去除轴突碎片, 这通常会导致细胞丢失。清洗几次用洗涤剂丰富的缓冲剂帮助释放细胞内的脂肪碎片, 从而提高产量。根据本协议, 从单个小鼠中消化两个全长坐骨神经, 产生≥30,000 单核事件, 至少3次从根背根中检索到这个数字。CD45 的+白细胞的比例约5% 的总细胞含量的坐骨神经消化和约5-10% 在根背根消化. 坐骨神经中的大多数 CD45+细胞表达了巨噬 CD68 和 CD206。
Protocol
Representative Results
Discussion
坐骨神经含有很大比例的脂质, 如胆固醇, 由于髓鞘周围的神经轴突的内容。由于油脂的性质随温度变化, 在不同的温度下可以得到不同的结果。为了保证细胞的保存, 消化后的所有步骤都在冰上进行。为了使结果重现性起见, 建议保持一致性, 但在室温下执行步骤3.6 和3.7 可以提高产量。如果3.8 步的神经没有被充分消化, 小块神经将在网格上可见。在不充分消化的情况下, 在网格上保留的材料可以通…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了德意志 Forschungsgemeinschaft (DFG;SFB1118)。作者想感谢一周半跳 Erhardt 的大部分解剖和有用的传递这方面的知识, 并 Dr. 沃克 Eckstein 协助技术方面的流式细胞仪。
Materials
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve – tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies?. Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -. M., Leong, A. S. -. Y. How does antigen retrieval work?. Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
