Analisi delle cellule immuni in singolo nervo sciatico e del ganglio della radice dorsale da un singolo Mouse mediante citometria a flusso
Summary
Analisi quantitativa del contenuto della cella all’interno del nervo sciatico murino è difficile a causa della scarsità del tessuto. Questo protocollo descrive un metodo per la digestione del tessuto e preparazione che fornisce cellule sufficienti per analisi di citometria a flusso delle popolazioni delle cellule immuni dai nervi dei topi individuali.
Abstract
Nervo-residente cellule immuni nel sistema nervoso periferico (PNS) sono essenziali per mantenere l’integrità di un neurone in un nervo sano. Le cellule immunitarie del PNS sono colpite da infortunio e malattia, che colpisce la funzione del nervo e la capacità di rigenerazione. Un neurone cellule immuni sono comunemente analizzate mediante immunofluorescenza (IF). Mentre se è essenziale per determinare la posizione delle cellule immunitarie nel nervo, se è solo semi-quantitativa e il metodo è limitato al numero di marcatori che possono essere analizzati contemporaneamente e il grado di espressione di superficie. In questo studio, citometria a flusso è stato utilizzato per l’analisi quantitativa di infiltrazione leucocitaria nei nervi sciatici o gangli di radice dorsale (DRG) di topi individuali. Singola cella analisi è stata eseguita utilizzando DAPI e diverse proteine sono stati analizzati simultaneamente per espressione intracellulare o superficie. Entrambi i nervi sciatico da un mouse che sono stati trattati secondo questo protocollo generato ≥ 30.000 singoli nucleate eventi. La proporzione dei leucociti nei nervi sciatico, determinati dall’espressione di CD45, era circa 5% del contenuto totale delle cellule del nervo sciatico e circa 5-10% in DRG. Questo protocollo si concentra principalmente sulla popolazione delle cellule immuni all’interno il PNS, la flessibilità della citometria a flusso per misurare simultaneamente un numero di marcatori significa che le altre popolazioni di cellule presenti all’interno del nervo, quali le cellule di Schwann, periciti , fibroblasti e cellule endoteliali, possono anche essere analizzate usando questo metodo. Questo metodo fornisce pertanto un nuovo mezzo per studiare gli effetti sistemici su PNS, quali neurotoxicology e modelli genetici di neuropatia o nelle malattie croniche, come il diabete.
Introduction
Le cellule immuni che immettere il PNS dalla circolazione, come definito dall’espressione di CD45 e CD11b, aiutano a mantenere l’integrità del nervo e gioca un ruolo sia nella degenerazione e rigenerazione1. I macrofagi (definiti dalla loro espressione di CD68 nel topo) possono essere sbilanciati verso un fenotipo infiammatorio, esprimendo più MHC classe II e CD86 sulla loro superficie (M1), o verso un fenotipo anti-infiammatorio, esprimendo più CD206 intracellulare (M2)2 . Inclinazione del fenotipo del macrofago è un processo dinamico regolato attraverso Akt segnalazione3, che riflette i diversi compiti di macrofagi nella difesa contro gli agenti patogeni (M1) e il ruolo nella rigenerazione tissutale (M2). Rigenerazione di un nervo danneggiato richiede innanzitutto la fagocitosi di residui del myelin dai macrofagi nel nervo4,5e anti-infiammatori (CD68+CD206+) M2 macrofagi sono stati indicati per promuovere la crescita assonale nella PNS6. Ridotto reclutamento o macrofagi a PNS, o alterata capacità di fagocitosi può provocare alterata rigenerazione e mantenimento dell’integrità del nervo. Macrofagi infiammatori di M1, che esprimono MHC di classe II, sono meno capaci di fagocitosi di macrofagi M2, e l’infiammazione di un neurone è implicata nella patogenesi di diverse malattie di neurodegenerative7.
I cambiamenti che si verificano per il sistema immunitario residente del nervo come conseguenza di danni possono essere quantitativi, che si manifesta nella perdita di CD45+ leucociti (o infiltrazione di CD45 è aumentato+ leucociti in causa infiammazione), o qualitativa, come cambiamento del fenotipo del macrofago da M2 a fenotipo M1. Le cellule immunitarie del PNS tradizionalmente sono state analizzate per mezzo di se, utilizzando le sezioni congelate o paraffina materiale8. Se è necessaria per determinare la localizzazione delle cellule di interesse. Tuttavia, quantificazione utilizzando se spesso si basa sul conteggio un relativamente piccolo numero di cellule in una sezione stretta del tessuto, rendendo la quantificazione inaffidabile e vulnerabile a bias di selezione. Per l’identificazione di specifici sottoinsiemi di cellule del sistema immunitario, la rilevazione simultanea di marcatori extracellulare o intracellulare è necessaria, mentre la determinazione del fenotipo del macrofago richiede almeno almeno due indicatori, in particolare CD206 e MHC Classe II. Come più comunemente microscopi disponibili sono limitati a canali almeno due colori, ad esempio isotiocianato di fluorescina (FITC) e ficoeritrina (PE), la caratterizzazione dei sottoinsiemi specifici di cellule immuni da IF può essere restrittiva e incompleti, che richiedono la necessità di avere più diapositive, derivato dalla stessa zona di interesse, che sono macchiati e analizzati in parallelo. Questo aspetto richiede molto tempo, pertanto non necessario si presta all’analisi di insiemi di grandi campioni. Inoltre, come la maggior parte degli indicatori di interesse sono extracellulare, la rilevazione nel tessuto, che è stato incorporato sia in paraffina o crioconservati, può essere problematica dovuto la rottura della integrità della membrana e il mascheramento degli epitopi, così come la perdita di gli antigeni di interesse dall’uso di solventi quali acetone e metanolo9.
Al contrario, il flusso cytometry, che misura ottica e caratteristiche di fluorescenza di singole cellule in sospensione che passano attraverso un fascio di luce, fornisce un mezzo più pratico e completo per l’analisi delle popolazioni cellulari. Citometria a flusso, piuttosto che produrre un’immagine digitale del tessuto, fornisce una quantificazione automatizzata dei parametri impostati, che includono la dimensione relativa e indice riflettente, indicato come il forward scatter (FSC), complessità granularità/interna di una cella o lato-scatter (SSC) e l’intensità di fluorescenza relativa, fornendo che la cella è stata etichettata con un fluoroforo appropriato, ad esempio un anticorpo coniugato. Un citometro a flusso tipico è costituito da due, Laser raffreddato ad aria; un laser ad argon produce luce blu a 488 nm e un laser elio-neon produce luce a 633 nm. Questa combinazione consente la rilevazione e misura, contemporaneamente, di almeno cinque obiettivi o sulla superficie o all’interno del compartimento intracellulare. Citometri a flusso più avanzate possono essere costituito da più laser, che consentono la rilevazione di fino a otto differenti fluorocromi contemporaneamente, fornendo che le lunghezze d’onda di picco delle emissioni dei fluorocromi selezionati non si sovrappongono in modo significativo.
Per l’analisi di citometria a flusso, il tessuto di interesse deve prima essere enzimaticamente digerito, generalmente con collagenasi, per generare una sospensione unicellulare. L’analisi dei nervi sciatico murini precedentemente è stata difficile a causa della piccola quantità di tessuto ottenuto da ogni mouse. Inoltre, l’alto contenuto di grassi del myelin intorno gli assoni ostacola il recupero delle cellule e produce grandi quantità di detriti. Il metodo descritto nel presente documento per la digestione e preparazione del nervo sciatico è stato adattato dal protocollo di isolamento delle cellule di Schwann di Barrette et al. 7e mira a isolare cellule abbastanza dai nervi dei topi individuali per l’analisi di citometria a flusso, al fine di ridurre le variazioni fra i topi. Utilizzando DAPI per l’identificazione delle singole cellule nel digest di tessuto grezzo elude la necessità di rimuovere i detriti dell’assone, che comunemente conduce a perdita delle cellule. Lavaggio più volte con un aids detergente ricco buffer nel rilascio di cellule intrappolate all’interno i residui grassi, aumentando così il rendimento. Digestione di entrambi i nervi sciatici full-length da un singolo mouse secondo questo protocollo genera ≥ 30, 000 singoli eventi nucleati e almeno 3 volte quel numero è stato Estratto da DRG. La proporzione di CD45+ leucociti era circa il 5% del contenuto totale di cellule nel nervo sciatico digest e circa 5-10% nel digest DRG. La maggior parte del CD45+ cellule nel nervo sciatico hanno espresso i marcatori del macrofago, CD68 e CD206.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nervo sciatico contengono una grande percentuale di lipidi, come il colesterolo, a causa del contenuto di myelin intorno gli assoni. Poiché la proprietà dei lipidi cambia con la temperatura, è possibile ottenere risultati diversi a temperature diverse. Per garantire la conservazione delle cellule, tutti i punti in questo protocollo dopo la digestione sono stati effettuati su ghiaccio. Mentre la consistenza è consigliato per motivi di riproducibilità dei risultati, è possibile aumentare la resa attenendosi alla proc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SFB1118). Gli autori vorrei ringraziare Axel Erhardt per eseguire la maggior parte della dissezione e utilmente trasmettere questa conoscenza e Dr. Volker Eckstein per assistere sotto l’aspetto tecnico del citofluorimetro.
Materials
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve – tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
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