Análisis de las células inmunes en solo de los nervios ciático y de ganglio de raíz Dorsal de un ratón mediante citometría de flujo
Summary
Análisis cuantitativo de contenido de la celda dentro del nervio ciático murino es difícil debido a la escasez del tejido. Este protocolo describe un método para la digestión del tejido y la preparación que proporciona suficientes células para el análisis de citometría de flujo de poblaciones de células inmunitarias de los nervios de los ratones.
Abstract
Residente del nervio las células inmunes en el sistema nervioso periférico (PNS) son esenciales para mantener la integridad neuronal en un nervio sano. Las células inmunes de la PNS son afectadas por lesiones y enfermedad, que afecta a la función del nervio y la capacidad de regeneración. Las células inmunes neuronales comúnmente son analizadas por inmunofluorescencia (IF). Mientras que si es esencial para determinar la ubicación de las células inmunes en el nervio, si es solamente semicuantitativa y el método se limita al número de marcadores que se pueden analizar simultáneamente y el grado de expresión superficial. En este estudio, citometría de flujo se utilizó para el análisis cuantitativo de la infiltración de leucocitos en los nervios ciáticos o ganglios de raíz dorsal (GRD) de los ratones. Realizó el análisis unicelular con DAPI y varias proteínas se analizaron simultáneamente para la expresión superficie o intracelular. Ambos nervios ciático de un ratón que fueron tratados de acuerdo con este protocolo genera 30.000 eventos nucleados simples ≥. La proporción de leucocitos en los nervios ciáticos, determinados por la expresión de CD45, fue aproximadamente 5% del contenido total de células en el nervio ciático y aproximadamente 5-10% en el DRG. Aunque este protocolo se centra principalmente en la población de células inmunitarias en el PNS, la flexibilidad de la citometría de flujo para medir un número de marcadores simultáneamente significa que las otras poblaciones de células presentes dentro del nervio, tales como las células de Schwann, pericitos , fibroblastos y células endoteliales, pueden también ser analizadas utilizando este método. Por lo tanto, este método proporciona nuevos medios para el estudio de efectos sistémicos en el PNS, como neurotoxicología y modelos genéticos de la neuropatía o enfermedades crónicas como la diabetes.
Introduction
Las células inmunes que entran en el PNS de la circulación, según lo definido por la expresión de CD45 y CD11b, ayudan a mantener la integridad del nervio y desempeñar un papel tanto en regeneración y degeneración1. Macrófagos (definidos por la expresión de CD68 en ratón) pueden ser sesgados hacia un fenotipo inflamatorio, expresando más MHC de clase II y CD86 en la superficie (M1), o hacia un fenotipo antiinflamatorio, expresando más CD206 intracelular (M2)2 . Sesgo del fenotipo macrófago es un proceso dinámico que regula a través de Akt señalización3, reflejando las diferentes tareas de macrófagos en la defensa contra patógenos (M1) y el papel en la regeneración de los tejidos (M2). Regeneración de un nervio lesionado primero requiere la fagocitosis de la ruina del myelin por macrófagos en el nervio4,5y antiinflamatorios (CD68+CD206+) M2 macrófagos se han demostrado para promover la extensión del axón en el PNS6. Reduce reclutamiento o macrófagos en el PNS, o deteriorada capacidad de fagocitosis puede resultar en deterioro de la regeneración y mantenimiento de la integridad del nervio. Inflamatorios macrófagos M1, expresan MHC de clase II, son menos capaces de la fagocitosis de macrófagos M2, y la inflamación neuronal está implicada en la patogenia de varias enfermedades de neurodegenerative7.
Los cambios que ocurren al nervio residente sistema inmune como consecuencia del daño pueden ser cuantitativos, que se manifiesta en la pérdida de CD45+ leucocitos (o aumento de la infiltración de CD45+ leucocitos en la inflamación de casos), o cualitativos, tales como cambio de fenotipo de macrófago de M2 a M1 fenotipo. Las células inmunes de la PNS tradicionalmente se han analizado mediante si, utilizando las secciones congeladas o material parafina-encajado8. IF es necesario para determinar la localización de las células de interés. Sin embargo, cuantificación usando si a menudo se basa en el recuento de un número relativamente pequeño de células en una sección estrecha del tejido, hacer cuantificación fiable y vulnerable a sesgo de selección. Para la identificación de subconjuntos específicos de las células inmunes, la detección simultánea de marcadores intracelulares o extracelulares se requiere, mientras que la determinación del fenotipo macrófago requiere al menos al menos dos marcadores, específicamente CD206 y MHC clase II. Más comúnmente microscopios disponibles son limitados a los canales de al menos dos colores, como el isotiocianato de fluoresceína (FITC) y ficoeritrina (PE), la caracterización de los subconjuntos específicos de células inmunes por IF puede ser restrictivo e incompleto, que requiere la necesidad de tener varias diapositivas, derivado de la misma área de interés, que son manchados y analizados en paralelo. Este aspecto requiere mucho tiempo, por lo tanto no necesario se presta para el análisis de conjuntos de muestras grandes. Además, como la mayoría de los marcadores de interés son extracelular, la detección de tejido, que tampoco ha sido incrustado en parafina o cryoconserved, puede ser problemática debido a la interrupción de la integridad de la membrana y el enmascaramiento de los epitopos, así como la pérdida de los antígenos de interés por el uso de solventes como acetona y metanol9.
En cambio, flujo cytometry, que mide óptica y características de fluorescencia de células en suspensión su paso a través de un haz de luz, proporciona un medio más práctico y completo para el análisis de las poblaciones celulares. Citometría de flujo, en lugar de producir una imagen digital del tejido, proporciona una cuantificación automatizada de parámetros establecidos, que incluyen el tamaño relativo de la célula y el índice reflexivo, conocido como la dispersión hacia delante (FSC), complejidad interna granularidad o lado-scatter (SSC) y la intensidad de fluorescencia relativa, proporcionando que la célula ha sido marcada con un fluoróforo adecuado, como un anticuerpo conjugado. Un citómetro de flujo típica consta de dos láseres refrigerados por aire; un láser de argón produce luz azul a 488 nm y un láser de helio-neón produce luz a 633 nm. Esta combinación permite la detección y la medida, al mismo tiempo, de al menos cinco objetivos en la superficie o dentro del compartimiento intracelular. Citómetros de flujo más avanzado pueden consistir en múltiples láseres, que permiten la detección de hasta ocho diferentes fluorocromos a la vez, proporcionar que las longitudes de onda de emisión de pico de los fluorocromos seleccionados no se superponen significativamente.
Para el análisis por citometría de flujo, el tejido de interés debe primero ser enzimático digerido, generalmente con colagenasa, para generar una suspensión unicelular. El análisis de los nervios ciáticos murinos anteriormente ha sido difícil debido a la pequeña cantidad de tejido Obtenido de cada ratón. Además, el alto contenido de grasa de la mielina alrededor de los axones dificulta la recuperación de la célula y produce grandes cantidades de desechos. El método descrito en este documento para la digestión y preparación del nervio ciático fue adaptado por el protocolo de aislamiento de las células de Schwann de Barrette et al. 7y tiene como objetivo aislar suficientes células de los nervios de los ratones para el análisis de citometría de flujo, con el fin de reducir la variación entre ratones. Usando DAPI para la identificación de las células en la síntesis de tejido crudo evita la necesidad de eliminar los desechos del axón, que comúnmente conduce a la pérdida de la célula. Lavar varias veces con un SIDA almacenador intermediario rico en detergente en la liberación de células atrapados dentro de los restos de grasa, aumentando así el rendimiento. Digestión de ambos nervios ciático cuerpo entero de un solo ratón según este protocolo genera ≥30, 000 eventos nucleados simples y por lo menos 3 veces ese número fue obtenido del DRG. La proporción de CD45+ leucocitos fue de aproximadamente el 5% del contenido total de la célula en la recopilación del nervio ciático y aproximadamente 5-10% en la recopilación de la DRG. La mayoría de la CD45+ las células en el nervio ciático expresaron los marcadores de macrófagos CD68 y CD206.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nervios ciáticos contienen una gran proporción de lípidos como el colesterol, debido a su contenido de mielina alrededor de los axones. Puesto que las propiedades de los lípidos cambian con la temperatura, pueden obtenerse resultados distintos a diferentes temperaturas. Para garantizar la preservación de la célula, todas las medidas en el presente Protocolo después de la digestión fueron realizadas en hielo. Mientras que la consistencia se recomienda por la reproducibilidad de los resultados, es posible aumentar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SFB1118). Los autores desean agradecer a Axel Erhardt para realizar la mayor parte de la disección y provechoso transmitir este conocimiento y el Dr. Volker Eckstein para ayudar en el aspecto técnico de la citometría de flujo.
Materials
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve – tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
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