Analyse af immunceller i enkelt ischiadicus nerver og dorsalrods Ganglion fra et enkelt museklik bruge flowcytometri
Summary
Kvantitativ analyse af celleindhold inden for murine iskiasnerven er vanskelig på grund af knaphed på vævet. Denne protokol beskriver en metode til væv fordøjelse og præparat, der giver tilstrækkelig celler flow flowcytometri analyse af immun cellepopulationer fra nerver af individuelle mus.
Abstract
Nerve-resident immun celler i det perifere nervesystem (PNS) er afgørende for at opretholde neuronal integritet i en sund nerve. Immunceller af PNS påvirkes af skade og sygdom, som påvirker nervefunktion og kapacitet til regenerering. Neuronal immunceller er almindeligt analyseret ved immunofluorescens (IF). Mens hvis er essentielle for placering af immunceller i nerve, hvis er kun semi-kvantitative og metoden er begrænset til antallet af mærker, der kan analyseres samtidig og graden af overflade udtryk. I denne undersøgelse, blev flowcytometri brugt til kvantitativ analyse af leukocyt perkolatnedsivning i ischiadicus nerver eller dorsalrods ganglier (DRG) af individuelle mus. Enkelt celle analyse blev udført ved hjælp af DAPI og flere proteiner blev analyseret samtidigt til enten overflade eller intracellulære udtryk. Begge ischiadicus nerver fra en mus, der blev behandlet efter denne protokol genereret ≥ 30.000 enkelt nukleeret begivenheder. Andelen af leukocytter i ischiadicus nerver, bestemmes af udtryk for CD45, var ca. 5% af samlede celleindholdet i iskiasnerven og ca 5-10% i DRG. Selv om denne protokol fokuserer primært på befolkningens immun celle i PNS, betyder fleksibilitet af flowcytometri at måle en række markører samtidig, at de andre celler befolkninger stede i nerve, såsom Schwann celler, pericytes , fibroblaster og endotelceller, kan også analyseres ved hjælp af denne metode. Denne metode giver derfor et nyt middel til at studere systemiske virkninger på PNS, såsom neurotoxicology og genetiske modeller af neuropati eller kroniske sygdomme som sukkersyge.
Introduction
Immunceller, der indtaste PNS fra omsætning, hjælpe som defineret af udtryk for CD45 og CD11b, med at bevare integriteten af nerve og spille en rolle både i regenerering og degeneration1. Makrofager (defineret ved deres ekspression af CD68 i mus) kan være skæv i retning af en inflammatorisk fænotype, udtrykker flere MHC klasse II og CD86 på deres overflade (M1), eller mod en anti-inflammatorisk fænotype, udtrykker flere intracellulære CD206 (M2)2 . Skævvridning af makrofag fænotype er en dynamisk proces reguleret gennem Akt signalering3, og som afspejler de forskellige opgaver af makrofager i forsvar mod patogener (M1) og rolle i væv revitalisering (M2). Regenerering af en skadet nerve først kræver fagocytose af myelin resterne af makrofager i nerve4,5, og anti-inflammatoriske (CD68+CD206+) M2 makrofager har vist sig at fremme axon udvækst i den PNS6. Reduceret ansættelse eller makrofager til PNS eller nedsat arbejdsevne fagocytose kan resultere i forringet regenerering og vedligeholdelse af nerve integritet. Inflammatorisk M1 makrofager, udtrykker MHC klasse II, er mindre i stand af fagocytose end M2 makrofager, og neuronal betændelse er involveret i patogenesen af flere neurodegenerative sygdomme7.
De ændringer, der opstår på nerve bosiddende immunsystemet som følge af skader kan være kvantitative, manifesterer sig i tab af CD45+ leukocytter (eller øget infiltration af CD45+ leukocytter i sag betændelse), eller kvalitative, som ændring af makrofag fænotype fra M2 til M1 fænotype. Immunceller af PNS har traditionelt analyseret ved hjælp af IF, ved hjælp af frosne snit eller paraffin-embedded materiale8. Hvis der kræves til bestemmelse af lokalisering af celler af interesse. Dog afhængig kvantificering ved hjælp af hvis ofte tælle et relativt lille antal celler i en smal del af væv, gør kvantificering upålidelige og sårbare over for udvalg bias. Til identifikation af specifikke delmængder af immunceller er samtidige påvisning af ekstracellulære og/eller intracellulære markører påkrævet, mens bestemmelse af makrofag fænotype kræver mindst mindst to markører, specielt CD206 og MHC klasse II. Som oftest tilgængelige mikroskoper er begrænset til mindst to-farve kanaler, såsom fluorescein isothiocyanat (FITC) og phycoerythrin (PE), kan karakterisering af de specifikke delmængder af immunceller af hvis være begrænsende og ufuldstændige, der kræver behovet for at have flere dias, stammer fra det samme område af interesse, der er plettet og analyseret parallelt. Dette tidskrævende aspekt derfor ikke nødvendige egner sig analysen af stor stikprøve sæt. Desuden, som de fleste af markørerne af interesse er ekstracellulære, påvisning i væv, der enten er blevet integreret i paraffin eller cryoconserved, kan være problematisk på grund af afbrydelse af membran integritet og maskering af epitoper, samt tab af antigener af interesse fra brugen af opløsningsmidler, acetone og methanol9.
Derimod flyde flowcytometri, som måler optisk og fluorescens Karakteristik af enkelt celler i suspension som de passerer gennem en stråle af lys, giver en mere praktisk og omfattende midler til analyse af cellepopulationer. Flowcytometri, i stedet for at producere et digitalt billede af væv, giver en automatiseret kvantificering af sæt parametre, som omfatter en celles relative størrelse og reflekterende indeks, omtales som den forward scatter (FSC), granulering/indre kompleksitet eller side-scatter (SSC) og relative fluorescens intensitet, at give, at cellen er blevet stemplet med et passende fluorophore, såsom en konjugeret antistof. Et typisk flow forskellige består af to, luftkølede lasere; en argon laser producerer blåt lys på 488 nm og en helium-neon-laser producerer lys på 633 nm. Denne kombination giver mulighed for påvisning og måling, samtidig, i hvert fald fem mål på overfladen eller inden for den intracellulære rum. Mere avanceret flow cytometers kan bestå af flere lasere, som giver mulighed for påvisning af op til otte forskellige fluorokromer på én gang at give, at peak emission bølgelængder af de valgte fluorokromer ikke overlapper betydeligt.
Til at analysere ved flowcytometri, skal vævet af interesse først enzymatisk fordøjes, generelt med collagenase, til at generere en enkelt celle suspension. Analyse af murine ischiadicus nerver har tidligere været vanskelig på grund af den lille mængde af væv fremstillet af hver mus. Desuden det høje fedtindhold af myelin omkring axoner hæmmer celle opsving og producerer store mængder af snavs. Den metode beskrevet heri for iskiasnerven forberedelse og fordøjelsen blev tilpasset fra Schwann celle isolation protokol af Barrette et al. 7, og har til formål at isolere nok celler fra nerver af individuelle mus for flow flowcytometri analyse, for at reducere variation mellem mus. Ved hjælp af DAPI til identifikation af enkelt celler i rå væv digest omgår behovet for at fjerne axon snavs, hvilket ofte fører til celletab. Vask flere gange med en vaskemiddel-rige buffer aids i udgivelsen af celler fanget i den fede vragrester, dermed øger udbyttet. Fordøjelsen af både fuld længde ischiadicus nerver fra en enkelt mus efter denne protokol genererer ≥30, 000 enkelt nukleeret begivenheder og mindst 3 gange så mange var hentet fra DRG. Andelen af CD45+ leukocytter var ca. 5% af samlede celleindholdet i iskiasnerven digest og ca 5-10% i DRG-digest. Fleste af CD45+ celler i iskiasnerven udtrykt makrofag markører, CD68 og CD206.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ischiadicus nerver indeholder en stor del af lipider, såsom kolesterol, på grund af indholdet af myelin omkring axoner. Da egenskaberne for lipider ændres med temperaturen, kan forskellige resultater opnås ved forskellige temperaturer. For at sikre celle bevarelse, blev alle trin i denne protokol efter fordøjelsen udført på is. Mens sammenhæng anbefales af hensyn til reproducerbarhed, kan det være muligt at øge udbyttet ved at udføre trin 3.6 og 3.7 ved stuetemperatur. Hvis nerver på trin 3.8 ikke har været …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SFB1118). Forfatterne vil gerne takke Axel Erhardt for at gennemføre de fleste af dissektion og hjælpsomt sender denne viden, og Dr. Volker Eckstein for at bistå i det tekniske aspekt af flow Flowcytometret.
Materials
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve – tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies?. Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -. M., Leong, A. S. -. Y. How does antigen retrieval work?. Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
