एकल Sciatic नसों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण और एक एकल माउस से पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि प्रवाह का उपयोग कर Cytometry
Summary
murine sciatic तंत्रिका के भीतर कोशिका सामग्री का मात्रात्मक विश्लेषण ऊतक की कमी के कारण मुश्किल है । इस प्रोटोकॉल ऊतक पाचन और तैयारी है कि व्यक्तिगत चूहों की नसों से प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्रदान करता है के लिए एक विधि का वर्णन ।
Abstract
परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) में तंत्रिका-निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एक स्वस्थ तंत्रिका में ंयूरॉंस अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं । पीएन की प्रतिरक्षा कोशिकाओं चोट और रोग से प्रभावित कर रहे हैं, तंत्रिका समारोह को प्रभावित करने और पुनर्जनन के लिए क्षमता । ंयूरॉन प्रतिरक्षा कोशिकाओं सामांयतः इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा विश्लेषण कर रहे है (यदि) । जबकि अगर तंत्रिका में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थान का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है, अगर केवल अर्द्ध मात्रात्मक है और विधि मार्करों की संख्या है कि एक साथ विश्लेषण किया जा सकता है और सतह अभिव्यक्ति की डिग्री तक ही सीमित है । इस अध्ययन में, प्रवाह cytometry ल्युकोसैट घुसपैठ के मात्रात्मक विश्लेषण sciatic नसों या पृष्ठीय रूट ganglions (DRGs) में व्यक्तिगत चूहों के लिए इस्तेमाल किया गया था । एकल सेल विश्लेषण DAPI का उपयोग किया गया था और कई प्रोटीन या तो सतह या intracellular अभिव्यक्ति के लिए एक साथ विश्लेषण कर रहे थे । एक माउस से दोनों sciatic नसों कि इस प्रोटोकॉल के अनुसार इलाज किया गया ≥ ३०,००० एकल nucleated घटनाओं उत्पंन । sciatic नसों में ल्यूकोसाइट्स का अनुपात, CD45 की अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित, sciatic तंत्रिका में कुल सेल सामग्री के लगभग 5% और डीआरजी में लगभग 5-10% था । हालांकि इस प्रोटोकॉल पीएन के भीतर प्रतिरक्षा कोशिका जनसंख्या पर मुख्य रूप से केंद्रित है, प्रवाह cytometry का लचीलापन एक साथ मार्करों की संख्या को मापने के लिए एक साथ इसका मतलब है कि अन्य कोशिकाओं Schwann कोशिकाओं के रूप में तंत्रिका के भीतर मौजूद आबादी, pericytes , fibroblasts, और endothelial कोशिकाओं, भी इस पद्धति का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । इस विधि इसलिए पीएन पर प्रणालीगत प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक नया साधन प्रदान करता है, जैसे न्यूरोपैथी के neurotoxicology और आनुवंशिक मॉडल या मधुमेह जैसे पुराने रोगों में.
Introduction
प्रतिरक्षा कोशिकाओं जो संचलन से पीएन दर्ज करें, के रूप में CD45 और CD11b की अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित, तंत्रिका की अखंडता को बनाए रखने और पुनर्जनन और अध…1में एक भूमिका दोनों खेलने में मदद । मैक्रोफेज (माउस में CD68 की उनकी अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित) एक भड़काऊ phenotype की ओर टेढ़ा किया जा सकता है, अधिक MHC वर्ग द्वितीय और CD86 उनकी सतह (M1) पर व्यक्त, या एक विरोधी भड़काऊ phenotype के प्रति, अधिक intracellular CD206 व्यक्त (M2)2 . macrophage phenotype के विषम एक गतिशील प्रक्रिया के माध्यम से विनियमित है3संकेतन, रोगजनकों के खिलाफ रक्षा में मैक्रोफेज के विभिंन कार्यों को दर्शाती है (M1) और ऊतक पुनर्जनन (M2) में भूमिका । एक घायल तंत्रिका के उत्थान पहले तंत्रिका4,5में मैक्रोफेज द्वारा myelin मलबे की phagocytosis की आवश्यकता है, और विरोधी भड़काऊ (CD68+CD206+) M2 मैक्रोफेज में axon वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है पीएन6. कम भर्ती या पीएन, या phagocytosis के लिए ख़राब क्षमता के लिए मैक्रोफेज बिगड़ा पुनर्जनन और तंत्रिका अखंडता के रखरखाव में परिणाम हो सकता है । भड़काऊ M1 मैक्रोफेज, MHC वर्ग द्वितीय व्यक्त, M2 मैक्रोफेज से phagocytosis के कम सक्षम हैं, और कई रोगजनन रोगों के neurodegenerative में न्यूरॉन सूजन फंसाया जाता है7.
परिवर्तन है कि क्षति का एक परिणाम के रूप में तंत्रिका निवासी प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए हो सकता है मात्रात्मक, CD45 के नुकसान में प्रकट+ ल्यूकोसाइट्स (या मामले में सूजन CD45+ ल्यूकोसाइट्स की वृद्धि हुई घुसपैठ), या गुणात्मक, जैसे macrophage phenotype का परिवर्तन M2 से M1 phenotype. पीएन की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को परंपरागत रूप से अगर के माध्यम से विश्लेषण किया गया है, जमे हुए वर्गों या आयल-एंबेडेड सामग्री का उपयोग कर8। यदि ब्याज की कोशिकाओं के स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है । हालांकि, अगर अक्सर ऊतक के एक संकीर्ण अनुभाग में कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या की गिनती पर निर्भर करता है का उपयोग कर, ठहराव ठहराव चयन पूर्वाग्रह के लिए अविश्वसनीय और कमजोर बना रही है । प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विशिष्ट सबसेट की पहचान के लिए, extracellular और/या intracellular मार्कर के एक साथ का पता लगाने की आवश्यकता है, whilst macrophage phenotype के निर्धारण कम से कम दो मार्करों की आवश्यकता है, विशेष रूप से CD206 और MHC द्वितीय श्रेणी । के रूप में सबसे अधिक से अधिक उपलब्ध सूक्ष्मदर्शी fluorescein isothiocyanate (FITC) और phycoerythrin (पीई), प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विशिष्ट सबसेट के लक्षण वर्णन के रूप में अगर सीमित और अधूरा हो सकता है, की आवश्यकता के रूप में कम से कम दो रंग चैनल, एकाधिक स्लाइड, ब्याज की एक ही क्षेत्र है, जो दाग और समानांतर में विश्लेषण कर रहे है से व्युत्पंन की जरूरत है । इस समय उपभोक्ता पहलू इसलिए आवश्यक नहीं है खुद को बड़े नमूना सेट के विश्लेषण के लिए उधार दे । इसके अलावा, के रूप में ब्याज की मार्कर के सबसे extracellular हैं, ऊतक में पता लगाने, जो या तो तेल या cryoconserved में एंबेड किया गया है, झिल्ली अखंडता के विघटन और epitopes के मास्किंग के कारण समस्याग्रस्त किया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में के नुकसान एसीटोन और मेथनॉल9जैसे सॉल्वैंट्स के उपयोग से ब्याज की एंटीजन ।
इसके विपरीत, प्रवाह cytometry, जो निलंबन में एकल कोशिकाओं के ऑप्टिकल और प्रतिदीप्ति विशेषताओं के उपाय के रूप में वे प्रकाश की एक किरण के माध्यम से पारित, सेल आबादी के विश्लेषण के लिए एक और अधिक व्यावहारिक और व्यापक साधन प्रदान करता है । प्रवाह cytometry, बजाय ऊतक के एक डिजिटल छवि का निर्माण, सेट मापदंडों, जो एक सेल रिश्तेदार आकार और चिंतनशील सूचकांक शामिल है की एक स्वचालित ठहराव प्रदान करता है, आगे तितर बितर (FSC) के रूप में निर्दिष्ट, दानेदार/ साइड-कैटरिंग (SSC), और सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रदान करने वाले, सेल को एक उपयुक्त fluorophore के साथ लेबल किया गया है, जैसे कि संयुग्मित एंटीबॉडी. एक ठेठ प्रवाह cytometer दो, एयर कूल्ड पराबैंगनीकिरण के होते हैं; एक आर्गन लेजर ४८८ एनएम पर नीले प्रकाश का उत्पादन और एक हीलियम-नियॉन लेजर ६३३ एनएम पर प्रकाश पैदा करता है । इस संयोजन का पता लगाने और माप के लिए अनुमति देता है, इसके साथ ही, या तो सतह पर या intracellular डिब्बे के भीतर कम से कम पांच लक्ष्यों की । अधिक उन्नत प्रवाह cytometers कई पराबैंगनीकिरण से मिलकर बना सकते हैं, जो एक बार में आठ विभिन्न fluorochromes तक का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं, जो कि चयनित fluorochromes के पीक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को महत्वपूर्ण रूप से ओवरलैप नहीं करते हैं ।
प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण के लिए, ब्याज की ऊतक पहले enzymatically पच, आम तौर पर collagenase के साथ होना चाहिए, एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए. murine sciatic नसों का विश्लेषण पहले एक चूहे से प्राप्त ऊतक की छोटी राशि के कारण मुश्किल हो गया है । इसके अलावा, axons के आसपास myelin के उच्च वसा सामग्री सेल वसूली में बाधा और मलबे की बड़ी मात्रा में पैदा करता है । विधि sciatic तंत्रिका तैयारी और पाचन के लिए यहां वर्णित बैरेट एट अल के Schwann सेल अलगाव प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया था । 7, और प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत चूहों की नसों से पर्याप्त कोशिकाओं को अलग करना है, ताकि चूहों के बीच भिन्नता को कम करने के लिए करना है । कच्चे ऊतक डाइजेस्ट में एकल कोशिकाओं की पहचान के लिए DAPI का उपयोग axon मलबे, जो सामांयतः कोशिका हानि की ओर जाता है हटाने की आवश्यकता को दरकिनार । फैटी मलबे के भीतर फंसे कोशिकाओं की रिहाई में एक डिटर्जेंट युक्त बफर एड्स के साथ कई बार धुलाई, जिससे उपज में वृद्धि । इस प्रोटोकॉल के अनुसार एक ही माउस से दोनों पूर्ण लंबाई sciatic तंत्रिकाओं के पाचन ≥ ३०,००० एकल nucleated घटनाओं और डीआरजी से प्राप्त किया गया था कि संख्या से कम 3 बार उत्पंन करता है । CD45+ ल्यूकोसाइट्स के अनुपात sciatic तंत्रिका डाइजेस्ट में कुल सेल सामग्री का लगभग 5% था और डीआरजी डाइजेस्ट में लगभग 5-10% । sciatic तंत्रिका में CD45+ कोशिकाओं के बहुमत macrophage मार्करों, CD68 और CD206 व्यक्त की है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Sciatic नसों लिपिड के एक बड़े अनुपात होते हैं, जैसे कोलेस्ट्रॉल, axons के आसपास myelin की सामग्री के कारण. तापमान के साथ लिपिड परिवर्तन के गुण के बाद से विभिन्न तापमान पर विभिन्न परिणाम प्राप्त किया जा सकता है । सेल ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थित किया गया था (DFG; SFB1118) । लेखक विच्छेदन के सबसे प्रदर्शन और सहायक इस ज्ञान संचारण के लिए एक्सल Erhardt शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और प्रवाह cytometer के तकनीकी पहलू में सहायता के लिए डॉ Volker Eckstein ।
Materials
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve – tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
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