Analyse av immunceller i enkelt Sciatic nerver og Dorsal Root Ganglion fra en enkelt mus med flowcytometri
Summary
Kvantitativ analyse av celleinnholdet i murine sciatic nerve er vanskelig på grunn av knapphet på vevet. Denne protokollen beskriver en metode for vev fordøyelsen og forberedelse som gir nok celler for flyt cytometri analyse av immun celle populasjoner fra nerver av personlige mus.
Abstract
Nerve-resident immunceller i perifere nervesystemet (PNS) er avgjørende for å opprettholde nevronale integritet i en sunn nerve. Immunceller av PNS påvirkes av skader og sykdom, påvirker nerve funksjon og kapasiteten for gjenfødelse. Neuronal immunceller analyseres vanligvis av immunofluorescence (hvis). Mens hvis er viktig for å bestemme plasseringen av immunceller i nerve, hvis er bare semi kvantitative og metoden er begrenset til antallet indikatorer som kan analyseres samtidig og graden av overflaten uttrykk. I denne studien ble flowcytometri brukt kvantitativ analyse av leukocytter infiltrasjon i sciatic nerver eller dorsal root ganglions (DRGs) av personlige mus. Enkelt celle analyse var utført ved hjelp av DAPI og flere proteiner ble analysert samtidig overflate eller intracellulær uttrykk. Begge sciatic nerver fra en mus som ble behandlet i henhold til denne protokollen generert ≥ 30.000 enkelt kjerne hendelser. Andelen av leukocytter i sciatic nerver, bestemmes av uttrykk for CD45, var ca 5% av totale celleinnholdet i sciatic nerve og ca 5-10% i DRG. Selv om denne protokollen fokuserer primært på immun celle befolkningen i PNS, betyr fleksibiliteten til flowcytometri måle en rekke indikatorer samtidig at de andre celler populasjonene stede i nerve, som Schwann celler, pericytes , fibroblaster og endotelceller, kan også analyseres ved hjelp av denne metoden. Denne metoden gir derfor en ny måte for å studere systemiske effekter på PNS, som neurotoxicology og genetisk modeller av neuropathy eller kroniske sykdommer som diabetes.
Introduction
Immunceller som angir PNS fra sirkulasjonen, bidra som definert av uttrykk for CD45 og CD11b, til å opprettholde integriteten til nerve og spille en rolle både i gjenfødelse og degenerasjon1. Makrofager (definert av deres uttrykk for CD68 i mus) kan være forskjøvet mot en inflammatorisk fenotype, uttrykke mer MHC klasse II og CD86 på overflaten deres (M1) eller mot en anti-inflammatorisk fenotype, uttrykke mer intracellulær CD206 (M2)2 . Forvrenger av macrophage fenotypen er en dynamisk prosess regulert gjennom Akt signalering3, som reflekterer ulike oppgaver makrofager i forsvar mot patogener (M1) og rolle i vev gjenfødelse (M2). Regenerering av en skadet nerve først krever fagocytose av myelin rusk makrofager i nerve4,5, og anti-inflammatorisk (CD68+CD206+) M2 makrofager har vist seg å fremme axon utvekst i den PNS6. Redusert rekruttering eller makrofager til PNS, eller nedsatt evne til fagocytose kan føre til nedsatt regenerasjon og vedlikehold av nerve integritet. Inflammatorisk M1 makrofager, uttrykke MHC, klasse II er mindre i stand til fagocytose enn M2 makrofager og neuronal betennelse er involvert i patogenesen av flere nevrodegenerative sykdommer7.
Endringene skje til nerve bosatt immunsystem at skader kan være kvantitativ, manifestert i tap av CD45+ leukocytter (eller økt infiltrasjon av CD45+ leukocytter i tilfelle betennelse), eller kvalitative, som endring av macrophage fenotypen fra M2 til M1 fenotypen. Immunceller av PNS er tradisjonelt analysert ved hvis frosne snitt eller parafin-embedded materiale8. Hvis er nødvendig for å avgjøre lokaliseringen av cellene rundt. Imidlertid bruker kvantifisering bruker hvis ofte teller et relativt lite antall celler i en smal del av vev, gjør kvantifisering upålitelig og sårbare for utvalget bias. Identifikasjon av bestemte undergrupper av immunceller kreves samtidig påvisning av ekstracellulære og/eller intracellulær markører, mens fastsettelse av macrophage fenotypen krever minst to markører, spesielt CD206 og MHC klasse II. Som oftest tilgjengelige mikroskop er begrenset til minst to-farge kanaler, som fluorescein isothiocyanate (FITC) og phycoerythrin (PE), kan karakterisering av de spesifikke delsettene av immunceller hvis være restriktiv og ufullstendig, krever behovet for å ha flere lysbilder, avledet fra samme område av interesse, som er farget og analysert parallelt. Dette tidkrevende aspektet derfor ikke nødvendig egner seg til analyse av store Prøvesett. Videre, som de fleste av markørene av interesse er ekstracellulære, gjenkjenningen i vev, som enten er innebygd i parafin eller cryoconserved, kan være problematisk avbrudd i membranen integritet og maskering av epitoper og tap av antigener interesse fra bruk av løsemidler, for eksempel aceton eller metanol9.
Derimot flow cytometri, som måler optisk og fluorescens kjennetegner enkeltceller i suspensjon idet de passerer gjennom en stråle av lys, gir en mer praktisk og omfattende hjelp for analyse av celle populasjoner. Flowcytometri, i stedet for å produsere et digitalt bilde av vevet, gir en automatisert kvantifisering av angi parametere, som inkluderer en Celles relative størrelsen og reflekterende indeksen, kalles frem scatter (FSC), detaljnivå/intern kompleksitet eller side-xy (SSC) og relativ fluorescens intensitet, gir at cellen har blitt merket med en riktig fluorophore, for eksempel et konjugert antistoff. En typisk flyt cytometer består av to, luftkjølt lasere; en argon laser produserer blått lys på 488 nm og en helium-neon laser produserer lys i 633 nm. Denne kombinasjonen muliggjør av måling, samtidig, minst fem mål på overflaten eller innen til intracellulær kupeen. Mer avanserte flyt cytometers kan bestå av flere lasere, som tillater påvisning av opptil åtte ulike fluorochromes samtidig, gir at peak utslipp bølgelengder av de valgte fluorochromes ikke overlapper betydelig.
For analyse av flowcytometri, må vevet rundt først være enzymatisk fordøyd, vanligvis med collagenase, generere en enkeltcelle suspensjon. Analyse av murine sciatic nerver har tidligere vært vanskelig på grunn av den lille mengden av vev innhentes fra hver musen. I tillegg til høyt fettinnhold av myelin rundt axons hemmer celle utvinning og produserer store mengder avfall. Metoden beskrevet her for ischias nerven forberedelse og fordøyelsen ble tilpasset fra Schwann celle isolasjon protokollen for Barrette et al. 7og har som mål å isolere nok celler fra nerver av personlige mus for flyt cytometri analyse, for å redusere variasjon mellom mus. Bruke DAPI til å identifisere enkeltceller i rå vev fordøye omgår måtte fjerne axon rusk, som ofte fører til tap av cellen. Vask flere ganger med en detergent-rik buffer aids i utgivelsen av celler fanget i fet rusk, og dermed øke avkastningen. Fordøyelsen av både full lengde sciatic nerver fra et enkelt museklikk etter denne protokollen genererer ≥30, 000 enkelt kjerne hendelser og 3 ganger dette nummeret hentes fra DRG. Andelen CD45+ leukocytter var ca 5% av totale celleinnholdet i sciatic nerve fordøye og ca 5-10% i DRG fordøye. Fleste av CD45+ celler i sciatic nerve uttrykt macrophage markører, CD68 og CD206.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sciatic nerver inneholder en stor andel av lipider, som kolesterol, på grunn av innholdet i myelin rundt axons. Siden Egenskaper for lipider endrer seg med temperaturen, kan ulike resultater oppnås ved forskjellige temperaturer. For å sikre cellen bevaring, ble alle trinn i denne protokollen etter fordøyelsen utført på isen. Mens konsistens anbefales for reproduserbarhet resultatene, kan det være mulig å øke avkastningen ved å utføre trinn 3.6 og 3.7 ved romtemperatur. Hvis nervene trinn 3.8 ikke har vært til…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SFB1118). Forfatterne vil gjerne takke Axel Erhardt for gjennomføre mest av dissection og hjelpsomt overføre denne kunnskapen, og Dr. Volker Eckstein for å bistå i det tekniske aspektet av flyt-cytometer.
Materials
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve – tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies?. Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -. M., Leong, A. S. -. Y. How does antigen retrieval work?. Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
