أسلوب بسيط واستنساخه تحضير عينات الغشاء من الفئران المعزولة حديثا ميكروفيسيلس الدماغ
Summary
ويرد هنا، وسيلة لعزل ميكروفيسيلس الدماغ الفئران وإعداد عينات الغشاء. هذا البروتوكول له ميزة واضحة لإنتاج ميكروفيسيل المخصب العائد مع البروتين مقبول عينات من الحيوانات الفردية. ثم يمكن استخدام عينات لتحليل البروتين قوية في البطانة ميكروفاسكولار الدماغ.
Abstract
حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي) من أنسجة حيوية حاجز الذي يستجيب لمختلف المثيرات الفيزيولوجية المرضية والدوائية. هذه التغييرات الناتجة عن هذه المحفزات يمكن إلى حد كبير تعدل إيصال المخدرات إلى الدماغ، واستطراداً، يسبب تحديات كبيرة في علاج الجهاز العصبي المركزي (CNS) الأمراض. التغيرات BBB الكثيرة التي تؤثر على العلاج الصيدلاني، تنطوي على البروتينات التي هي مترجمة وأعرب على مستوى الخلايا البطانية. في الواقع، هذه المعرفة في علم وظائف الأعضاء BBB في الصحة والمرض أثارت اهتماما كبيرا في دراسة هذه البروتينات الغشاء. من وجهة نظر بحوث علوم أساسية، وهذا يعني الحاجة إلى طريقة بسيطة ولكنها قوية واستنساخه لعزل ميكروفيسيلس من أنسجة المخ حصادها من الحيوانات التجريبية. بغية إعداد عينات غشاء من ميكروفيسيلس طازجة معزولة، من الضروري أن الاستعدادات عينة أثري في خلايا بطانية لكن يقتصر حضور أنواع الخلايا الأخرى لوحدة نيوروفاسكولار (أي، أستروسيتيس، ميكروجليا، والخلايا العصبية، بيريسيتيس). ميزة إضافية هي القدرة على إعداد عينات من الحيوانات الفردية من أجل التقاط التغير الحقيقي التعبير البروتين في حالة سكان تجريبية. في هذه المخطوطة، ترد تفاصيل فيما يتعلق بطريقة التي تستخدم لعزل ميكروفيسيلس الدماغ الفئران وإعداد عينات الغشاء. تخصيب ميكروفيسيل، ومن العينات المستمدة، يتحقق باستخدام أربع خطوات استخدام الطرد المركزي حيث يتم تضمين ديكستران في المخزن المؤقت للعينة. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة بمختبرات أخرى للتطبيقات الخاصة بهم. وقد أظهرت العينات التي تم إنشاؤها من هذا البروتوكول أن تسفر عن بيانات تجريبية قوية من البروتين تحليل التجارب التي يمكن أن تساعد إلى حد كبير فهم الاستجابات BBB للمنبهات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية والدوائية.
Introduction
حاجز الدم في الدماغ (BBB) موجود في مجال التفاعل بين الجهاز العصبي المركزي (CNS) والدوران الجهازي وتلعب دوراً أساسيا في الحفاظ على التوازن في الدماغ. على وجه التحديد، مهام BBB دقة التحكم ذائبة التركيزات في الدماغ السائل خارج الخلية وكفاءة توفير تلك العناصر الغذائية المطلوبة بواسطة أنسجة المخ للوفاء بمطالب الأيضية كبيرة الجهاز العصبي المركزي1. هذه الأدوار يعني أن بي بي بي، القائم أساسا على مستوى الخلية البطانية microvascular، يجب أن تمتلك الآليات المنفصلة التي تمكن بعض المواد للوصول حمة الدماغ مع ضمان أن لا يمكن أن تكون ضارة xenobiotics تتراكم. في الواقع، خلايا الدماغ بطانية ميكروفاسكولار ليست فينيستراتيد ويحمل pinocytosis محدودة، مما يضمن عدم نفاذية غير انتقائية2. بالإضافة إلى ذلك، أعرب خلايا المخ ميكروفيسيل بطانية البروتينات مفرق ضيق مفرق وأدهيرينس أن تتصرف بشكل مادية “ختم” بين الخلايا المتجاورة بطانية وتقيد إلى حد كبير باراسيلولار نشر المواد المنقولة بالدم في الدماغ حمة. في الواقع، يتطلب انتقائية نفاذية المواد الداخلية والخارجية للتعبير الوظيفي من الناقلين الإقبال وافلوكس3. تقاطعات عموما، ضيق، والوصلات أدهيرينس والناقلين العمل يدا واحدة للحفاظ على خصائص فريدة من نوعها الحاجز بي بي بي.
BBB هو حاجز حيوي الذي يستجيب للمنبهات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية والدوائية. على سبيل المثال، الإجهاد نقص/ريوكسيجينيشن قد ثبت أن تعدل تعبير البروتينات مفرق ضيق الحرجة (أي، أوككلودين، زونولاي أوككلودين-1 (زوي-1))، الذي يرتبط مع باراسيلولار زيادة نفاذية لعلامات الأوعية الدموية مثل كما السكروز4،،من56. ملاحظات مماثلة بذلت في بي بي بي في الإعداد للدماغ إصابة7 و8،الألم التهابات الطرفية9. يمكن أيضا أن تعدل هذه الأمراض نفس آليات النقل في BBB10،11،12،،من1314. والواقع أن يعزز إصابة نقص/ريوكسيجينيشن التعبير الوظيفي للعضوية شاردة نقل 1a4 ببتيد (Oatp1a4) في بي بي بي، الذي يمكن أن يؤدي إلى زيادات كبيرة في نقل الدم إلى الدماغ من ركائز النقل أواتب محددة مثل توروتشولاتي واتورفاستاتين13. ويمكن أيضا تغيير خصائص BBB بالعلاج الصيدلاني نفسه، إليه التي يمكن أن تشكل أساسا لكل التغيرات العميقة في فعالية العقاقير في الدماغ والتفاعلات المخدرات-المخدرات. على سبيل المثال، أسيتامينوفين أهداف مستقبلات النووية آليات إرسال الإشارات في خلايا الدماغ بطانية microvascular، يزيد التعبير الوظيفي للناقل efflux الحرجة فبروتين سكري (ف-gp)، ويعدل التسكين تعتمد على الوقت يمنحها المورفين، المخدرات مسكن افيوني والمنشأة فسباق الجائزة الكبرى والنقل الركازة15. فهم دقيق للتغيرات BBB، الذي يمكن أن يتسبب بالأمراض أو بالمخدرات، كما يتطلب تحديد وتوصيف الآليات التنظيمية المحددة التي تتحكم في هذه التعديلات. وفي الواقع، قد حددت مسارات الإشارات المنفصلة في خلايا بطانية microvascular الدماغ التي تتحكم في التعبير الجزيئي من مفرق ضيق البروتينات16،17 ومتعهدي النقل15، 18،19. وتشير هذه الملاحظات مجتمعة إلى أن مسارات جزيئية معقدة تشارك في تنظيم تقاطعات ضيق BBB والناقلين في الصحة والمرض.
تحديا كبيرا في دراسة BBB هو الشرط المطلق لطريقة بسيطة وفعالة لعزل ميكروفيسيلس من أنسجة المخ المستمدة من الحيوانات التجريبية وإعداد عينات الغشاء اللاحقة. يجب أن يكون مستعدا هذه العينات حيث أن هي على حد سواء أثرت في خلايا الدماغ بطانية ميكروفاسكولار ومحدودة في وجود أنواع الخلايا الأخرى. على مدى السنوات العديدة الماضية، أبلغ عن منهجيات متعددة لعزل ميكروفاسكولاتوري من الدماغ القوارض في المؤلفات العلمية13،20،،من2122. توضح هذه المقالة بسيطة، قوية، وأسلوب استنساخه لعزل ميكروفيسيلس من الدماغ الفئران وإعداد عينات غشائي غشاء عالي التخصيب التي يمكن استخدامها لتحليل التعبير البروتين. ميزة هذا البروتوكول العزلة ميكروفيسيل هو القدرة على الحصول على عينة الاستعدادات ذات جودة عالية ومع كافية البروتين العائد من الحيوانات تجريبية فردية. وهذا يتيح النظر في التفاوت بين الحيوانات في التعبير البروتين. مثل سلفه في هذا البروتوكول قد تحسنت كثيرا على متانة الدراسات بي بي بي لأنه يمكن الآن تجنب الإفراط في تقدير (أو بخس التقدير) من الحجم الحقيقي للتغييرات البروتين في بي بي بي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إدراج عدة خطوات استخدام الطرد المركزي مع ديكستران تخصيب محسنة من ميكروفيسيلس في العينات التجريبية بينما يسهل إزالة المكونات الخلوية غير المرغوب فيها مثل الخلايا العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، هو وصف طريقة بسيطة وفعالة لإعداد عينات البروتين غشاء من ميكروفيسيلس طازجة المعزولة من أنسجة المخ الفئران. وأبلغ عدة نهج لعزل ميكروفيسيلس الدماغ الفئران و/أو جيل من الاستعدادات غشاء من ميكروفاسكولاتوري معزولة في الأدب13،20،،من<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01-NS084941) ولجنة البحوث الطبية الحيوية أريزونا (ADHS16-162406) إلى PTR. وقد تلقت وا في الماضي دعم من تعيينا قبل دكتوراه على “المعاهد الوطنية لمنحه التدريب الصحي” (T32-HL007249).
Materials
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?. AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
