Un método Simple y Reproducible para preparar muestras de membrana de microvasos de cerebro recién aislado de rata
Summary
Aquí, se describe un método para el aislamiento de microvasos de cerebro de rata y para la preparación de las muestras de la membrana. Este protocolo tiene la ventaja clara de producir enriquecido microvessel muestras con proteínas aceptable rendimiento de animales individuales. Muestras pueden utilizarse para análisis de proteína sólida en el endotelio microvascular cerebral.
Abstract
La barrera blood – brain (BBB) es un tejido de barrera dinámica que responde a varios estímulos fisiopatológicos y farmacológicos. Tales cambios resultantes de estos estímulos pueden grandemente modular la entrega de la droga al cerebro y, por extensión, causan grandes desafíos en el tratamiento del sistema nervioso central (SNC) enfermedades. Muchos cambios BBB que afectan a la farmacoterapia, involucran proteínas que son localizadas y expresadas en el nivel de las células endoteliales. De hecho, tales conocimientos sobre fisiología BBB en salud y enfermedad ha despertado considerable interés en el estudio de estas proteínas de membrana. Desde un punto de vista de investigación de ciencia básica, esto implica un requisito para un método simple pero robusto y reproducible para el aislamiento de los microvasos del tejido de cerebro de animales experimentales. Para preparar muestras de membrana de microvasos recién aislados, es imprescindible que preparaciones de muestra enriquecidas en células endoteliales pero limitadas en presencia de otros tipos de la célula de la unidad neurovascular (astrocitos, microglía y neuronas, pericitos). Un beneficio adicional es la capacidad para preparar muestras de animales individuales con el fin de captar la verdadera variabilidad de expresión de proteínas en una población experimental. En este manuscrito, se proporcionan detalles con respecto a un método que se utiliza para aislamiento de microvasos de cerebro de rata y preparación de muestras de la membrana. Enriquecimiento de microvasos, de muestras derivadas, se logra con cuatro pasos de centrifugación donde dextrano está incluido en el tampón de muestra. Este protocolo puede ser adaptado fácilmente por otros laboratorios para sus aplicaciones específicas. Muestras generadas de este protocolo se han demostrado para producir datos experimentales sólidos de los experimentos de análisis de proteína que pueden ayudar grandemente a la comprensión de las respuestas BBB a estímulos fisiológicos, fisiopatológicos y farmacológicos.
Introduction
La barrera blood – brain (BBB) existe en la interfase entre el sistema nervioso central (SNC) y la circulación sistémica y juega un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis cerebral. Específicamente, las funciones BBB a precisamente control soluto concentraciones en el líquido extracelular cerebral y suministrar eficientemente los nutrientes requeridos para satisfacer las demandas metabólicas considerable del CNS1por tejido cerebral. Estas funciones implican que el BBB, que existe principalmente en el nivel de la célula endotelial microvascular, debe poseer mecanismos discretos que permiten algunas sustancias a parénquima cerebral asegurando que xenobióticos potencialmente perjudiciales no se acumulan. De hecho, las células endothelial microvasculares del cerebro no son fenestradas y exhiben limitada pinocitosis, que aseguran que la falta de permeabilidad no selectiva2. Además, las células endoteliales de cerebro microvessel expresan firmemente proteínas cruce cruce y adherentes que actúan a la forma física “sello” entre las células endoteliales adyacentes y restringir enormemente difusión paracelular de sustancias transmitidas por la sangre en cerebro parénquima. De hecho, la permeabilidad selectiva de sustancias endógenas y exógenas requiere expresión funcional de transportadores de la absorción y flujo de salida de3. Uniones en generales, firmemente, las uniones y transportistas trabajan en conjunto para mantener las propiedades de la única barrera de la BBB.
El BBB es una barrera dinámica que responde a los estímulos fisiológicos, fisiopatológicos y farmacológicos. Por ejemplo, se ha demostrado estrés hipoxia/reoxygenation para modular la expresión de proteínas de Unión estrecha crítica (es decir, occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), que se asocia con permeabilidad paracelular mayor para marcadores vasculares como sacarosa4,5,6. Observaciones similares se han realizado en el BBB en el ajuste de lesión de cerebro traumática7 y dolor inflamatorio periférico8,9. Estas mismas enfermedades también pueden modular los mecanismos de transporte en el BBB10,11,12,13,14. De hecho, lesión hipoxia/reoxygenation mejora la expresión funcional del anión orgánico transporte polipéptido 1a4 (Oatp1a4) en el BBB, que puede conducir a aumentos significativos en el transporte de sangre al cerebro de sustratos específicos de transporte de Oatp tales como taurocholate de atorvastatina13. Propiedades BBB también pueden ser modificados por la farmacoterapia, un mecanismo que puede formar una base para ambos cambios profundos en la eficacia de la droga en el cerebro y las interacciones de los fármacos. Por ejemplo, mecanismos de señalización acetaminofén objetivos del receptor nuclear en las células endothelial microvasculares del cerebro, aumenta la expresión funcional del transportador de eflujo crítica P-glicoproteína (P-gp) y modifica la analgesia dependiente del tiempo conferidos por la morfina, un fármaco analgésico opiáceo y P-gp establecido transportan sustrato15. Una profunda comprensión de los cambios BBB, que puede ser inducida por enfermedades o por drogas, también requiere la identificación y caracterización de mecanismos específicos que controlan estas modificaciones. De hecho, se han identificado vías de señalización discretas en células endothelial microvasculares del cerebro que controlan la expresión molecular de ensambladura apretada proteínas16,17 y transportistas15, 18,19. Tomados en conjunto, estas observaciones indican que vías moleculares complejas están involucradas en la regulación de uniones estrechas BBB y transportadores en salud y enfermedad.
Un reto importante en el estudio de la BBB es el requisito indispensable de un método simple y eficaz para el aislamiento de los microvasos del tejido cerebral derivado de animales de experimentación y posterior preparación de las muestras de la membrana. Estas muestras deben estar preparadas para que sean tanto enriquecidos en las células endothelial microvasculares del cerebro y limitadas en presencia de otros tipos de células. En los últimos años, múltiples metodologías para el aislamiento de la microcirculación del cerebro de roedor se han divulgado en la literatura científica13,20,21,22. Este artículo describe un método reproducible para el aislamiento de microvasos del cerebro de la rata y para la preparación de las muestras enriquecidas con membrana endoteliales que puede utilizarse para el análisis de expresión de la proteína y simple, robusto. Una ventaja de este protocolo de aislamiento de microvasos es la capacidad para obtener preparaciones de muestra de alta calidad y con la suficiente producción de proteínas de un animal experimental individual. Esto permite la consideración de la variabilidad entre animal en la expresión de la proteína. Tal un avance en el presente Protocolo ha mejorado considerablemente la robustez de los estudios BBB porque sobrestimación o subestimación de la verdadera magnitud de los cambios de la proteína en el BBB ahora puede ser evitada. Además, la inclusión de múltiples pasos de centrifugación con dextrano permite mayor enriquecimiento de microvasos en muestras experimentales facilitando la eliminación de componentes celulares no deseados como las neuronas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, se describe un método simple y eficaz de preparación de muestras de proteínas de membrana de microvasos recién aisladas de tejido cerebral de rata. Varios enfoques para aislamiento de microvasos de cerebro de rata o generación de las preparaciones de membrana de microvasculatura aislada se han divulgado en la literatura13,20,21,22 , 24….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los institutos nacionales de salud (R01-NS084941) y la Comisión de investigación biomédica de Arizona (ADHS16-162406) al PTR. WA ha recibido más allá del apoyo de una cita de predoctoral a nacional institutos de salud entrenamiento becado (T32-HL007249).
Materials
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
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