新鮮単離ラット脳微小循環から膜のサンプルを準備するシンプルで再現性のある方法
Summary
ここでは、ラット脳微小血管の分離膜試料の調製の方法を説明します。このプロトコルには、個々 の動物から得られる許容可能なタンパク質試料濃縮微小血管を生産の明確な利点があります。サンプルは、脳微小血管内皮細胞で堅牢なタンパク質解析に使用できます。
Abstract
血液脳関門 (BBB) は、様々 な病態生理学的および薬理学的刺激に応答する動的なバリア組織です。これらの刺激の結果としてそのような変更大幅脳への薬物送達を調節でき、延長によって、病気の原因のかなりの挑戦中枢神経系の治療に (CNS)。薬物治療学に影響を与える多くの BBB 変更は、ローカライズは、内皮細胞のレベルで表現するタンパク質を含みます。確かに、健康および病気の BBB の生理学的な知識は、これらの膜タンパク質の研究に大きな関心を呼んでいます。基本的な科学研究の観点から、これは単純なが堅牢で再現性のある実験動物から採取した脳組織から血管の分離法のための要件を意味します。新鮮単離血管から膜サンプルを準備するためにサンプル準備が血管内皮細胞に富むが、単位 (すなわち、アストロ サイト、ミクログリア、ニューロンの他の細胞型の存在下で限定が肝要です。ペリサイト)。付加的な利点は、個々 の動物から実験群におけるタンパク質発現の真の変動を捕捉するためにサンプルを準備する機能です。本稿では、ラット脳微小血管の分離と膜試料の調製に利用されるメソッドに関する詳細情報が提供されます。派生した、サンプルの微小血管濃縮サンプル バッファーのデキストランをふくむ 4 遠心分離手順を使用して実現されます。このプロトコルは、特定のアプリケーションの他の所で簡単に対応できます。生理学的、病態生理学的、および薬理学的刺激への BBB 対応の理解を助けることができる大きくタンパク質解析実験から堅牢な実験データを生成するため、このプロトコルから生成されるサンプルを示されています。
Introduction
血液脳関門 (BBB) は、中枢神経系 (CNS) と全身循環間のインターフェイスに存在して、脳のホメオスタシスの維持に重要な役割を果たしています。具体的には、正確にコントロール溶質濃度1中枢神経系のかなり代謝要求を満たすために脳組織に必要なこれらの栄養素を効率よく供給して脳細胞外液中に BBB の機能。これらの役割は、微小血管内皮細胞のレベルに主に存在する、BBB は脳実質に潜在的に有害物質ができませんを確保しながらアクセスするいくつかの物質を有効に離散のメカニズムを持つ必要がありますを意味します。蓄積されます。確かに、脳微小血管内皮細胞は穴あきではなく、非選択的透過性2の欠如を保証する限られた pinocytosis を展示します。脳微小血管内皮細胞が物理的な隣接する血管内皮細胞間の「封印」と大きく脳に血液媒介物質の傍細胞拡散を制限するフォームに動作するタイトのジャンクションと adherens ジャンクション蛋白質を表現するさらに、実質。確かに、内因性および外因性物質の選択的な透磁率は、吸収と排出トランスポーター3の機能発現を必要とします。全体的に、タイトな接合、アドヘレンスジャンクション、トランスポーターは、BBB のユニークなバリア性を維持するためにコンサートで動作します。
BBB は生理学的、病態生理学的、および薬理学的刺激に応答する動的な障壁であります。たとえば、低酸素/再酸素化ストレスの増加傍細胞透過性このような血管マーカーに関連付けられている (すなわち、オクルディン、ギャップ occluden 1 (ZO-1))、重要なタイト結合タンパク質の発現を調節するのに示されています。ショ糖4,5,6。外傷性脳損傷7末梢炎症性疼痛8,9設定で bbb と同様の観測が行われました。これらの同じ病気の BBB10、11,12,13,14トランスポート メカニズムを調節することがまた。確かに、低酸素/再酸素化障害を高める有機アニオン輸送ポリペプチド 1a4 の機能発現 (Oatp1a4)、BBB でつながることができる特定ファミリートランスポーターの輸送基質の血液-脳輸送に大幅に増加するなどタウロコール酸とアトルバスタチンとの13。薬物療法自体は、脳の薬の効果の両方の深遠な変更および薬物-薬物相互作用の基礎を形成することができますメカニズムによって BBB プロパティを変更することも。たとえば、脳微小血管内皮細胞におけるアセトアミノフェン ターゲット核内受容体シグナル機構重要な排出トランスポーター P 糖タンパク質 (P ・ gp) の発現を増加し、時間依存性鎮痛を変更オピオイド鎮痛薬と確立された P gp は輸送基板15モルヒネによって与えられました。BBB の変更、病気や薬によって誘発されることができますの徹底的な理解は、これらの変更を制御する特定の規制メカニズムの同定と解析にも必要です。確かに、離散のシグナル伝達経路はタイト結合蛋白質16,17 , トランスポーター15,の分子の発現を制御する脳微小血管内皮細胞で確認されている18,19。一緒に取られて、これらの観察は、複雑な分子経路が健康および病気のトランスポーターの BBB のタイトな接合の規制に関与していることを示します。
BBB の研究で重要な課題は、微小血管に由来する実験動物及びその後膜サンプルの脳組織からの分離のためのシンプルで効果的なメソッドの絶対要件です。これらのサンプルは、脳微小血管内皮細胞の濃縮し、他の細胞型の存在の限定、両方準備されなければなりません。過去数年間、齧歯動物の脳から血管の隔離のための複数の方法論は、科学文献13,20,21,22で報告されています。ここでは、シンプルで堅牢な再現可能な方法ラット脳から微小血管の分離および蛋白質の表現の分析に使用することができます内皮膜濃縮試料の調製をについて説明します。この微小血管の隔離のプロトコルの利点は、個々 の実験動物から十分な蛋白質収量と高品質のサンプル準備を取得する機能です。これにより、間動物可変性蛋白質の表現の検討。このプロトコルのような進歩は、BBB で蛋白質の変更の本当の大きさの推定過剰 (または過少評価) を回避できますので BBB 研究の堅牢性を大幅に改善が。また、デキストランの遠心分離手順で複数の包含は、ニューロンなど不要な細胞成分の除去を促進しながら実験サンプルの微小血管についての改良濃縮できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では新鮮なラット脳組織から分離された微小血管からの膜蛋白質のサンプルの準備のシンプルで効果的な方法を説明します。文献13,20,21,22で孤立した血管からラット脳微小血管の分離および/または膜の準備世代のためのいくつかの方法が報告されています。,24. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、PTR に健康の国民の協会 (R01 NS084941)、(ADHS16-162406) アリゾナ州医学研究委員会からの補助金によって支えられました。ワシントン州は、過去の国家機関の健康研修助成金 (T32 HL007249) 博士前期予定からサポート受けています。
Materials
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?. AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
