Un metodo semplice e riproducibile per preparare campioni di membrana da microvasi cerebrali appena isolati del ratto
Summary
Qui, è descritto un metodo per l’isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana. Questo protocollo ha il chiaro vantaggio di produrre arricchito del microvessel campioni con proteina accettabile resa da singoli animali. Campioni possono quindi essere utilizzati per analisi di robusta proteina presso l’endotelio microvascolare cerebrale.
Abstract
Emato – encefalica (BBB) è un tessuto barriera dinamica che risponde ai vari stimoli fisiopatologici e farmacologici. Tali cambiamenti derivanti da questi stimoli possono notevolmente modulano la consegna della droga per il cervello e, per estensione, causano notevoli sfide nel trattamento del sistema nervoso centrale (CNS) malattie. Molte modifiche BBB che interessano la farmacoterapia, coinvolgono proteine localizzate ed espresse a livello delle cellule endoteliali. Infatti, tale conoscenza sulla fisiologia BBB nella salute e nella malattia ha suscitato notevole interesse nello studio di queste proteine di membrana. Da un punto di vista di ricerca di scienza di base, ciò implica un requisito per un metodo semplice ma robusto e riproducibile per l’isolamento dei microvasi dal tessuto di cervello raccolto da animali da esperimento. Per preparare campioni di membrana da microvasi appena isolati, è indispensabile che la preparazione del campione essere arricchiti in cellule endoteliali ma limitati in presenza di altri tipi di cellule dell’unità neurovascolare (cioè, gli astrociti, microglia, neuroni, periciti). Un ulteriore vantaggio è la possibilità di preparare i campioni da singoli animali al fine di acquisire la vera variabilità dell’espressione della proteina in una popolazione sperimentale. In questo manoscritto, vengono forniti dettagli per quanto riguarda un metodo che viene utilizzato per l’isolamento di microvasi cerebrali di ratto e preparazione dei campioni di membrana. Arricchimento del microvessel, dai campioni derivati, è ottenuta utilizzando quattro fasi di centrifugazione dove destrano è incluso nel buffer del campione. Questo protocollo può essere facilmente adattato da altri laboratori per le proprie applicazioni specifiche. Campioni generati da questo protocollo sono stati indicati per produrre dati sperimentali affidabili da esperimenti di analisi di proteine che possono notevolmente facilitare la comprensione delle risposte BBB a stimoli fisiologici, fisiopatologici e farmacologici.
Introduction
Emato – encefalica (BBB) esiste a livello di interfaccia tra il sistema nervoso centrale (SNC) e la circolazione sistemica e svolge un ruolo essenziale nel mantenimento dell’omeostasi del cervello. In particolare, le funzioni BBB al proprio controllo soluto le concentrazioni nel liquido extracellulare del cervello e di fornire in modo efficiente quei nutrienti necessari per soddisfare le richieste metaboliche considerevole del CNS1dal tessuto cerebrale. Questi ruoli implicano che la BBB, che esiste principalmente a livello della cellula endoteliale microvascolare, deve possedere meccanismi discreti che permettono alcune sostanze per accedere il parenchima cerebrale, garantendo nel contempo che xenobiotici potenzialmente dannosi non può si accumulano. Infatti, cellule endoteliali microvascolari del cervello non sono fenestrate e pinocitosi limitato, che assicura una mancanza di permeabilità non selettivo2per mostre. Inoltre, le cellule endoteliali del microvessel di cervello esprimono proteine di giunzione junction e adherens strette che agiscono per formare un fisico “sigillo” tra cellule endoteliali adiacenti e limitare notevolmente paracellulare diffusione di sostanze ematica nel cervello parenchima. Infatti, la permeabilità selettiva di sostanze endogene ed esogene richiede espressione funzionale di assorbimento e efflusso trasportatori3. Nel complessive, strette giunzioni, giunzioni intermedie e trasportatori funzionano di concerto per mantenere le proprietà di barriera unico della BBB.
La BBB è una barriera dinamica che risponde agli stimoli fisiologici, fisiopatologici e farmacologici. Ad esempio, ipossia/riossigenazione stress ha dimostrato di modulare l’espressione di proteine di giunzione critici (cioè, occludina, zonulae occluden-1 (ZO-1)), che è associato con permeabilità paracellulare aumentato per gli indicatori vascolari come saccarosio4,5,6. Osservazioni simili sono state effettuate a BBB nella regolazione della ferita di cervello traumatica7 e dolore infiammatorio periferico8,9. Queste stesse malattie possono anche modulare i meccanismi di trasporto presso le BBB10,11,12,13,14. Infatti, ipossia/riossigenazione aumenta l’espressione funzionale di anioni organici che trasporta il polipeptide 1a4 (Oatp1a4) presso la BBB, che può portare ad un aumento significativo del trasporto di sangue al cervello di substrati specifici di trasporto Oatp come taurocholate e atorvastatina13. BBB proprietà possono anche essere alterate dalla farmacoterapia stessa, un meccanismo che possa costituire una base per entrambi profondi cambiamenti nell’efficacia droga nel cervello e per interazioni farmaco-farmaco. Ad esempio, meccanismi di recettori nucleari di bersagli di acetaminofene segnalazione in cellule endoteliali microvascolari del cervello, aumenta l’espressione funzionale del trasportatore di efflusso critico P-glicoproteina (P-gp) e modifica l’analgesia dipendente dal tempo conferiti dalla morfina, un analgesico oppioide e stabilito P-gp trasporto substrato15. Una conoscenza approfondita delle modifiche BBB, che può essere indotta da malattie o da farmaci, richiede anche l’identificazione e caratterizzazione di specifici meccanismi regolatori che controllano queste modifiche. Infatti, le vie di segnalazione discrete sono state identificate in cellule endoteliali microvascolari del cervello che controllano l’espressione molecolare di giunzione stretta proteine16,17 e trasportatori15, 18,19. Prese insieme, queste osservazioni indicano che vie molecolari complesse sono coinvolti nella regolazione delle giunzioni strette BBB e trasportatori in salute e malattia.
Una sfida significativa nello studio della BBB è il requisito assoluto di un metodo semplice ed efficace per l’isolamento dei microvasi da tessuto cerebrale derivato da animali da esperimento e successiva preparazione dei campioni di membrana. Questi campioni devono essere preparati in modo che sono sia arricchite in cellule endoteliali microvascolari del cervello e limitati in presenza di altri tipi di cellule. Sopra i passato parecchi anni, molteplici metodologie per l’isolamento di microvasculature dal cervello del roditore sono stati segnalati nella letteratura scientifica13,20,21,22. Questo articolo viene descritto un semplice, robusto e un metodo riproducibile per l’isolamento dei microvasi dal cervello del ratto e per la preparazione di campioni arricchita di membrana endoteliali che può essere utilizzato per l’analisi dell’espressione della proteina. Un vantaggio di questo protocollo di isolamento del microvessel è la capacità di ottenere la preparazione del campione di alta qualità e con resa sufficiente di proteina da un singolo animale sperimentale. In questo modo la considerazione della variabilità nell’espressione della proteina. Tale un anticipo in questo protocollo ha migliorato notevolmente la robustezza degli studi BBB perché over-estimation (o sottovalutazione) della vera grandezza dei cambiamenti della proteina a BBB ora può essere evitato. L’inclusione di più fasi di centrifugazione con destrano consente inoltre di arricchimento migliorata di microvasi in campioni sperimentali, facilitando la rimozione di costituenti cellulari indesiderate quali neuroni.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, viene descritto un metodo semplice ed efficace di preparazione dei campioni di proteine di membrana da microvasi appena isolati dal tessuto di cervello di ratto. Diversi approcci per isolamento di microvasi cerebrali di ratto e/o generazione di preparazioni della membrana da microvasculature isolato sono stati segnalati in letteratura13,20,21,22 , <sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (R01-NS084941) e la Commissione di ricerca biomedica Arizona (ADHS16-162406) ptr. WA ha ricevuto in passato, il sostegno da un appuntamento pre-dottorato per un istituti nazionali di salute formazione Grant (T32-HL007249).
Materials
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
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