Een eenvoudige en reproduceerbare methode te bereiden membraan monsters van vers geïsoleerde Rat hersenen Microvessels
Summary
Hier wordt een methode voor het isoleren van de rat hersenen microvessels en voor de bereiding van de eindmonsters membraan beschreven. Dit protocol heeft het duidelijk voordeel van het produceren van verrijkte microvessel monsters met aanvaardbare eiwit van individuele dieren opbrengst. Steekproeven kunnen vervolgens worden gebruikt voor analyses van de robuuste proteïne in de hersenen microvasculaire endotheel.
Abstract
De bloed – hersenbarrière (BBB) is een dynamische barrière-weefsel dat op verschillende pathofysiologische en farmacologische stimuli reageert. Dergelijke veranderingen ten gevolge van deze prikkels kunnen sterk moduleren drug levering naar de hersenen en, bij uitbreiding, aanzienlijke uitdagingen bij de behandeling van het centrale zenuwstelsel (CNS) ziekten veroorzaken. Vele BBB veranderingen die invloed op farmacotherapie, waarbij eiwitten die zijn gelokaliseerd en uitgedrukt op het niveau van endotheliale cellen. Inderdaad, heeft deze kennis op BBB fysiologie in gezondheid en ziekte leidde tot aanzienlijke belangstelling voor de studie van deze membraaneiwitten. Vanuit een oogpunt van de fundamentele wetenschap onderzoek impliceert dit een verplichting voor een simpel maar robuust en reproduceerbare methode voor isolatie van de microvessels van hersenweefsel geoogst van proefdieren. Ter voorbereiding van membraan monsters van vers geïsoleerde microvessels, is het essentieel dat de staalvoorbereiding worden verrijkt in de endotheliale cellen maar in het bijzijn van andere celtypes van de neurovasculaire eenheid (dat wil zeggen, astrocyten, microglia, neuronen beperkt, pericytes). Een bijkomend voordeel is de mogelijkheid om voor te bereiden van monsters van individuele dieren om te vangen de ware variabiliteit van eiwit expressie in een experimentele bevolking. In dit manuscript vindt u details over een methode die wordt gebruikt voor isolatie van rat hersenen microvessels en bereiding van de monsters van het membraan. Verrijking van de Microvessel, van monsters afgeleid, wordt bereikt met behulp van vier centrifugeren stappen waar dextran is opgenomen in de steekproef buffer. Dit protocol kan gemakkelijk aangepast worden door andere laboratoria voor hun eigen specifieke toepassingen. Monsters die zijn gegenereerd op basis van dit protocol is aangetoond dat de opbrengst van robuuste experimentele gegevens van eiwit analyse experimenten die het begrip van BBB reacties op stimuli van farmacologische, fysiologische en pathofysiologische sterk kunnen helpen.
Introduction
De bloed – hersenbarrière (BBB) bestaat op het raakvlak tussen het centrale zenuwstelsel (CNS) en de systemische circulatie en speelt een essentiële rol in het behoud van de homeostase van de hersenen. In het bijzonder de BBB functies juist controle opgeloste concentraties in extracellulaire vloeistof van de hersenen en de voedingsstoffen die nodig zijn om te voldoen aan de aanzienlijke metabole eisen van de CNS1door hersenweefsel efficiënt te verstrekken. Deze rollen impliceren dat de BBB, die voornamelijk op het niveau van de microvasculaire endothelial cel bestaat, moet beschikken over een discrete mechanismen waarmee sommige stoffen tot hersenen parenchym en tegelijkertijd te garanderen dat potentieel schadelijke xenobiotica niet accumuleren. Inderdaad, microvasculaire endothelial hersencellen zijn niet fenêtré en vertonen beperkte Pinocytose, die zorgt voor een gebrek aan niet-selectieve permeabiliteit2. Bovendien express microvessel endothelial hersencellen tight junction en adherens junction eiwitten die te vormen een fysieke handelen “zegel” tussen aangrenzende endotheliale cellen en sterk beperken paracellular verspreiding van bloed overdraagbare stoffen in de hersenen Parenchym. Inderdaad, selectieve permeabiliteit van endogene en exogene stoffen vereist functionele uitdrukking van opname- en efflux vervoerders3. Algemene, strakke kruispunten, adherens kruispunten en vervoerders werken samen om de unieke barrière-eigenschappen van de BBB.
De BBB is een dynamische barrière die op farmacologische, fysiologische en pathofysiologische stimuli reageert. Bijvoorbeeld, is hypoxie/heroxygenatie stress aangetoond dat het moduleren van expressie van kritische tight junction eiwitten (dat wil zeggen, occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), die wordt geassocieerd met verhoogde paracellular permeabiliteit aan dergelijke vasculaire markeertekens als sacharose4,5,6. Vergelijkbare waarnemingen zijn gedaan bij de BBB in de omgeving van traumatische hersenen letsel7 en perifere inflammatoire pijn8,9. Deze dezelfde ziekten kunnen ook moduleren vervoer mechanismen op de BBB10,11,12,13,14. Inderdaad, hypoxie/heroxygenatie letsel verbetert functionele uitdrukking van organische anion vervoeren polypeptide 1a4 (Oatp1a4) op de BBB, die kunnen leiden tot een aanzienlijke stijging van het vervoer van bloed-aan-hersenen van specifieke Oatp vervoer substraten zoals taurocholate en Atorvastatine13. BBB eigenschappen kunnen ook worden gewijzigd door farmacotherapie zelf, een mechanisme dat kan een basis voor beide ingrijpende veranderingen in de effectiviteit van de drug in de hersenen en voor interactie van de drug-drug vormen. Bijvoorbeeld, signalering mechanismen van doelen van paracetamol nucleaire receptor in de hersenen microvasculaire endotheliale cellen, functionele expressie van de kritische efflux vervoerder P-glycoproteïne (P-gp) verhoogt, en wijzigt de tijd-afhankelijke analgesie verleend door morfine, vervoeren een opioïde pijnstillende drug en gevestigde P-gp substraat15. Een grondige kennis van BBB veranderingen, die kan worden opgewekt door ziekten of door drugs, vereist ook identificatie en karakterisering van specifieke regulerende mechanismen waarmee deze wijzigingen. Inderdaad, discrete signaalroutes zijn geïdentificeerd in hersenen microvasculaire endotheliale cellen die de moleculaire uitdrukking van strakke junction eiwitten16,17 en vervoerders15, bepalen 18,19. Samen genomen, deze opmerkingen aangeven dat complexe moleculaire pathways bij de regulering van BBB strakke kruispunten en vervoerders in zowel de volksgezondheid als de ziekte betrokken zijn.
Een belangrijke uitdaging in de studie van de BBB is de absolute vereiste van een eenvoudige en effectieve methode voor het isoleren van microvessels van hersenweefsel afkomstig van proefdieren en latere bereiding van de monsters van het membraan. Deze monsters moeten worden voorbereid, zodat ze zijn zowel met microvasculaire endothelial hersencellen verrijkt en in aanwezigheid van andere celtypes beperkt. In de afgelopen jaren, zijn meerdere methoden voor het isoleren van microvasculature van knaagdier hersenen gemeld in de wetenschappelijke literatuur13,20,21,22. Dit artikel beschrijft een eenvoudig, robuust, en reproduceerbare methode voor isolatie van de microvessels van de rat hersenen en voor de bereiding van endothelial membraan verrijkte monsters die kunnen worden gebruikt voor de analyse van eiwit expressie. Een voordeel van dit protocol van de isolatie microvessel is de mogelijkheid om een individuele proefdieren staalvoorbereiding van hoge kwaliteit en met voldoende eiwit opbrengst te verkrijgen. Hierdoor is de behandeling van dieren variabiliteit in eiwit expressie. Dergelijke een voorschot in dit protocol is sterk verbeterd de robuustheid van BBB studies omdat overschatting (of onder schatting) van de ware omvang van eiwit veranderingen bij de BBB kan nu worden vermeden. Daarnaast maakt de integratie van meerdere centrifugeren stappen met dextran verbeterde verrijking van microvessels in experimentele monsters terwijl het verwijderen van ongewenste cellulaire bestanddelen zoals neuronen vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel, wordt een eenvoudige en effectieve methode voor te bereiden membraan EiwitSteekproeven van microvessels vers geïsoleerd van rat hersenweefsel beschreven. Verschillende benaderingen voor isolatie van rat hersenen microvessels en/of generatie van membraan preparaten van geïsoleerde microvasculature zijn gemeld in de literatuur13,20,21,22 , 24. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01-NS084941) en de Arizona biomedisch onderzoek Commissie (ADHS16-162406) aan PTR. WA heeft ontvangen uit het verleden steun van een-gepromoveerde afspraak tot een nationale instituten van gezondheid opleiding verlenen (T32-HL007249).
Materials
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?. AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
