Membran örnekleri taze izole sıçan beyin yüzdeki hazırlamak için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem
Summary
Burada, sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve membran örnekleri hazırlanması için bir yöntemi açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı örnekleri kabul edilebilir protein ile bireysel hayvanlardan verim zenginleştirilmiş microvessel üreten açık avantajı vardır. Örnekleri daha sonra beyin mikrovasküler endotel, sağlam protein analizleri için kullanılabilir.
Abstract
Kan – beyin bariyerini (BBB) çeşitli patofizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt veren dinamik bariyer dokudur. Bu uyaranlara kaynaklanan bu tür değişiklikler büyük ölçüde ilaç dağıtım beyne modüle ve, uzantısı tarafından (CNS) hastalıkları merkezi sinir sistemi tedavisinde önemli sorunlar neden. Farmakoterapi, etkileyen birçok BBB değişiklikler lokalize ve endotel hücre düzeyinde ifade proteinleri içerir. Gerçekten de, böyle bir bilgiye BBB fizyolojisi sağlığı ve hastalıkları üzerinde insan bu membran proteinlerinin büyük ilgi yol açtı. Bir temel bilim araştırma açısından bu deneysel hayvan–dan hasat beyin dokusundan yüzdeki yalıtım için basit ama güçlü ve tekrarlanabilir bir yöntem için bir gereklilik anlamına gelir. Taze izole yüzdeki membran örnekleri hazırlamak için bu örnek hazırlıklar endotel hücrelerinde zenginleştirilmiş ama nörovasküler birimi (astrocytes, microglia, nöronlar, varlığında diğer hücre tipleri sınırlı esastır perisitlerden). Bir yararı protein ifadesi deneysel bir nüfus içinde gerçek değişkenliği yakalamak için bireysel hayvanlardan örnekleri hazırlamak için yeteneğidir. Bu el yazması kullanılmaktadır sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve membran örnekleri hazırlanması için bir yöntem ile ilgili ayrıntılar sağlanmaktadır. Örneklerinden elde edilen, microvessel zenginleştirme dextran örnek arabellekte nerede dahil dört Santrifüjü adımlar kullanılarak elde edilir. Bu iletişim kuralı diğer laboratuvarlar için kendi özel uygulamalar tarafından kolayca adapte edilebilir. Bu iletişim kuralı oluşturulan örnekleri üzerinden BBB yanıt fizyolojik, patofizyolojik ve farmakolojik uyaranlara karşı anlayış büyük ölçüde yardımcı olabilir protein analizi deneyler sağlam deneysel veri vermeye gösterilmiştir.
Introduction
Kan – beyin bariyerini (BBB), merkezi sinir sistemi (MSS) ve sistemik dolaşımı arasındaki arayüzü var ve beyin homeostazı bakım içinde önemli bir rol oynamaktadır. Özellikle, BBB işlevleri tam olarak kontrol çözünen konsantrasyonları beyin hücre dışı sıvı ve verimli bir şekilde beyin dokusu tarafından CNS1önemli metabolik taleplerini yerine getirmek için gerekli olan bu besin kaynağı. Öncelikle mikrovasküler endotel hücre düzeyinde var, BBB, potansiyel olarak zararlı xenobiotics yapamadığı sağlarken beyin parankimi erişmek bazı maddelerin etkinleştirmek ayrık mekanizmaları sahip olması gereken bu roller ima birikir. Nitekim, beyin mikrovasküler endotel hücreleri Poşlu değildir ve sigara seçici geçirgenlik2eksikliği sağlar sınırlı pinocytosis sergilemek. Ayrıca, beyin microvessel endotel hücreleri hızlı bir fiziksel “bitişik endotelyal hücreler arasında mühürle” ve büyük ölçüde kan kaynaklı maddeler paracellular Difüzyon beyin içine kısıtlamak formu için hareket sıkı Kavşağı ve adherens junction proteinler parankimi. Nitekim, seçici geçirgenlik endojen ve eksojen maddelerin alımı ve sızma taşıyıcı3fonksiyonel ifade gerektirir. Genel olarak, sıkı kavşaklar, adherens kavşaklar ve Işınlayıcılar konser BBB benzersiz bariyer özelliklerini korumak için çalışır.
BBB fizyolojik, patofizyolojik ve farmakolojik uyaranlara yanıt veren dinamik bir engeldir. Örneğin, hipoksi/reoxygenation stres vasküler işaretçileri için artan paracellular geçirgenliği ile ilişkili olduğu ifade (occludin,Yani, zonulae occluden-1 (ZO-1)), kritik sıkı kavşak proteinlerin modüle için gösterilen olarak sukroz4,5,6. Travmatik beyin hasarı7 ve çevresel enflamatuar ağrı8,9ortamda BBB, benzer gözlemler yapılmıştır. Bu aynı hastalıklar da taşıma mekanizmaları BBB10,11,12,13,14modüle. Nitekim, hipoksi/reoxygenation yaralanma organik anyon polipeptit 1a4 taşıma fonksiyonel ifade artırır (Oatp1a4) BBB, hangi yol açabilir için belirli Oatp taşıma yüzeylerde kan beyin taşımacılığının önemli artışlar gibi taurocholate atorvastatin ve13. BBB özellikleri, farmakoterapi kendisi, ilaç-ilaç etkileşimleri ve beyinde uyuşturucu etkinliği her iki derin değişiklikler için bir temel oluşturabilir bir mekanizma tarafından da değiştirilebilir. Örneğin, asetaminofen hedefleri nükleer reseptör sinyal mekanizmalar beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde kritik sızma ışınlama P-glikoprotein (P-gp) fonksiyonel ifade artırır ve zamana bağımlı analjezi değiştirir morfin tarafından doğan, bir opioid analjezik ilaç ve kurulan P-gp substrat15taşımacılığı. Hastalıklar veya uyuşturucu indüklenen, BBB değişiklikleri kapsamlı bir anlayış aynı zamanda kimlik ve bu değişiklikleri denetleyen belirli düzenleyici mekanizmaları karakterizasyonu gerektirir. Nitekim, ayrık sinyal yolları sıkı kavşak proteinler16,17 ve Işınlayıcılar15, moleküler ifade denetleyen beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde tespit edilmiştir 18,19. Birlikte ele alındığında, bu gözlemler karmaşık moleküler yolları BBB sıkı kavşak düzenlenmesi ve Işınlayıcılar sağlık ve hastalığında katılmaktadırlar gösterir.
BBB çalışmanın önemli bir mücadelesine izole yüzdeki beyin dokusundan deneysel hayvan ve membran örnekleri sonraki hazırlanması elde edilmesi için basit ve etkili bir yöntem mutlak zorunluluktur. Böylece onlar hem beyin mikrovasküler endotel hücrelerinde zenginleştirilmiş ve diğer hücre tipleri huzurunda sınırlı bu örnekler hazırlanmalıdır. Son birkaç yıl içinde–dan kemirgen beyin microvasculature yalıtım için birden fazla metodolojiler içinde bilimsel literatür13,20,21,22bildirilmiştir. Bu makalede bir basit, sağlam ve tekrarlanabilir yöntemi protein ifade analiz için kullanılabilecek endotel membran zenginleştirilmiş örnekleri hazırlanması ve yüzdeki–dan sıçan beyin yalıtım için. Bir avantaj bu microvessel yalıtım protokol örnek hazırlıklar kaliteli ve yeterli protein verim ile bireysel bir deneysel hayvan edinmek için yeteneğidir. Bu protein ifadesindeki arası hayvan değişkenlik dikkate sağlar. Protein değişiklikleri BBB, gerçek büyüklükte aşırı tahmini (veya altında tahmin) şimdi önlenebilir çünkü böyle bir önceden bu iletişim kuralı yer sağlamlık BBB çalışmaların büyük ölçüde iyileşmiştir. Ayrıca, birden çok Santrifüjü adımı dextran ile eklenmesi nöronlar gibi istenmeyen hücresel bileşenlerin kaldırılmasını kolaylaştırmak ise deneysel örneklerinde yüzdeki geliştirilmiş zenginlik sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, taze sıçan beyin dokusundan izole yüzdeki membran protein örnekleri hazırlama basit ve etkili bir yöntem açıklanmıştır. İzole microvasculature sıçan beyin yüzdeki yalıtım ve/veya membran hazırlıklar nesil için çeşitli yaklaşımlar içinde edebiyat13,20,21,22 bildirilmiştir , 24. microvessel yalıtım Protokolü yukarıda a?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser PTR için Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01-NS084941) ve Arizona Biyomedikal Araştırma Komisyonu (ADHS16-162406) gelen hibe tarafından desteklenmiştir. WA geçmiş bir ulusal kurumları sağlık eğitim Grant’ın (T32-HL007249) için önceden doktora bir randevudan destek aldı.
Materials
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?. AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
