Une méthode Simple et reproductible pour préparer les échantillons de la Membrane des microvaisseaux de cerveau de Rat fraîchement isolées
Summary
Ici, on décrit une méthode pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat et pour la préparation des échantillons de la membrane. Ce protocole a l’avantage clair de produire des microvaisseaux enrichi échantillons avec la protéine acceptable donnent sur des animaux. Échantillons peuvent être ensuite utilisés pour les analyses de protéines robuste à l’endothélium microvasculaire cérébral.
Abstract
La barrière sang – encéphalique (BHE) est un tissu de barrière dynamique qui répond à divers stimuli physiopathologiques et pharmacologiques. Ces changements résultant de ces stimuli peuvent grandement modulent les medicaments au cerveau et, par extension, causer des problèmes considérables dans le traitement du système nerveux central (CNS) des maladies. Nombreux changements BBB qui affectent la pharmacothérapie, impliquent des protéines qui sont localisées et exprimés au niveau des cellules endothéliales. En effet, ces connaissances sur la physiologie BBB dans la santé et la maladie a suscité un intérêt considérable pour l’étude de ces protéines membranaires. Dans une perspective de recherche sciences fondamentales, cela implique une exigence pour une méthode simple mais robuste et reproductible pour isolation des microvaisseaux de tissu cérébral récolté sur des animaux de laboratoire. Afin de préparer les échantillons de la membrane des microvaisseaux fraîchement isolées, il est essentiel que les préparations être enrichies dans les cellules endothéliales mais limitées en présence d’autres types de cellules de l’unité neurovasculaire (p. ex., astrocytes, la microglie, neurones, péricytes). Un autre avantage est la possibilité de préparer les échantillons provenant d’animaux individuels afin de capturer la véritable variabilité d’expression de protéine dans une population expérimentale. Dans ce manuscrit, on trouvera des précisions concernant une méthode qui est utilisée pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat et préparation des échantillons de la membrane. Enrichissement des microvaisseaux, provenant d’échantillons dérivés, est obtenue en utilisant les quatre étapes de centrifugation à où le dextran est inclus dans la solution tampon. Ce protocole peut être facilement adapté par d’autres laboratoires pour leurs propres applications spécifiques. Échantillons produits de ce protocole ont été démontrés pour produire des données expérimentales fiables des expériences d’analyse de protéines qui peuvent grandement aider à la compréhension des réponses BBB à des stimuli physiologiques, physiopathologiques et pharmacologiques.
Introduction
La barrière sang – encéphalique (BHE) existe à l’interface entre le système nerveux central (SNC) et la circulation systémique et joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie du cerveau. Plus précisément, les fonctions BBB précisément contrôle soluté à une concentration d’extracellulaire de cerveau pour alimenter efficacement les éléments nutritifs qui sont requis par les tissus du cerveau pour répondre aux exigences métaboliques considérables du CNS1. Ces rôles impliquent que la BHE, qui existe principalement au niveau de la cellule endothéliale microvasculaire, doit posséder des mécanismes discrets qui permettent à certaines substances d’accéder le parenchyme du cerveau tout en s’assurant que des xénobiotiques potentiellement dangereux ne peut pas s’accumulent. En effet, les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales ne sont pas fenêtrées et pièce limitée pinocytose, qui assure une absence de perméabilité non sélectif2. En outre, les cellules endothéliales du cerveau microvaisseaux expriment les protéines serrés de jonction junction et adherens qui agissent pour former un physique « sceller » entre les cellules endothéliales adjacentes et considérablement restreindre la diffusion paracellulaire de substances véhiculées par le sang dans le cerveau parenchyme. En effet, la perméabilité sélective de substances endogènes et exogènes requiert une expression fonctionnelle de la captation et l’efflux de transporteurs3. Les jonctions dans l’ensemble, serrées, jonctions adherens et les transporteurs travaillent de concert pour maintenir les propriétés de barrière unique de la BHE.
Le BBB est une barrière dynamique qui répond à des stimuli physiologiques, physiopathologiques et pharmacologiques. Par exemple, les contraintes d’hypoxie/réoxygénation s’est avéré modulent l’expression des protéines de jonction serrée critique (c.-à-d., occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), qui est associé de la perméabilité paracellulaire accrue à des marqueurs vasculaires telles comme le saccharose4,5,6. Des observations similaires ont été faites à la BHE dans le cadre du traumatisme cérébral lésion7 et douleur inflammatoire périphérique8,9. Ces mêmes maladies peuvent également moduler les mécanismes de transport à la BBB10,11,12,13,14. En effet, blessure d’hypoxie/réoxygénation améliore l’expression fonctionnelle des anions organiques transportant polypeptide 1 a 4 (Oatp1a4) à la BHE, qui peut conduire à une augmentation significative dans le transport de sang-de-cerveau des substrats spécifiques de transport Oatp tels que 13le taurocholate et l’atorvastatine. Propriétés BBB peuvent également être modifiées par pharmacothérapie lui-même, un mécanisme qui peut former une base pour les deux changements profonds dans l’efficacité du médicament dans le cerveau et interactions médicament-médicament. Par exemple, les mécanismes de signalisation acétaminophène cibles récepteur nucléaire dans les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau, augmente l’expression fonctionnelle efflux critique du transporteur de la P-glycoprotéine (P-gp) et modifie l’analgésie dépendant du temps conféré par la morphine, un médicament analgésique opioïde et établi P-gp transportent substrat15. Une compréhension approfondie des changements BBB, qui peut être induite par des maladies ou par des drogues, exige également l’identification et caractérisation des mécanismes réglementaires spécifiques qui contrôlent ces modifications. En effet, les voies de signalisation discrets ont été identifiés dans les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau qui contrôlent l’expression moléculaire de jonction serrée protéines16,17 et transporteurs15, 18,,19. Pris ensemble, ces observations indiquent que les voies moléculaires complexes interviennent dans la régulation des jonctions serrées de BBB et transporteurs en santé et en maladie.
Un défi important dans l’étude de la BHE est l’absolue nécessité d’une méthode simple et efficace pour l’isolation des microvaisseaux de tissu cérébral provenant d’animaux de laboratoire et préparation ultérieure des échantillons de la membrane. Ces échantillons doivent être préparés, afin qu’ils sont enrichis en cellules endothéliales microvasculaires du cerveau et limités en présence d’autres types de cellules. Au cours des dernières années, plusieurs méthodes pour l’isolement des capillaires du cerveau de rongeur ont été signalés dans la littérature scientifique13,20,21,22. Cet article décrit une simple, robuste et la méthode reproductible pour isolation des microvaisseaux du cerveau de rat et préparation des échantillons endothéliales de membrane enrichi qui peut être utilisé pour l’analyse de l’expression de la protéine. Un avantage de ce protocole d’isolement microvaisseaux est la possibilité d’obtenir des préparations de haute qualité et avec un rendement suffisant de protéines d’un animal expérimental. Cela permet l’examen des animale variabilité dans l’expression de la protéine. Cette avance dans le présent protocole a grandement amélioré la robustesse des études BBB car surestimation ou sous-estimation de l’ampleur réelle des changements de la protéine à la BHE peut désormais être évitée. En outre, l’inclusion de plusieurs étapes de centrifugation avec dextran permet enrichissement améliorée des microvaisseaux dans des échantillons de laboratoire tout en facilitant l’élimination des constituants cellulaires indésirables tels que les neurones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, on décrit une méthode simple et efficace de préparation des échantillons de protéines de membrane des microvaisseaux fraîchement isolées du tissu de cerveau de rat. Plusieurs approches pour l’isolement des microvaisseaux de cerveau de rat ou de la génération des préparations membranaires de microcirculation isolée ont été signalés dans la littérature13,20,21,22</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Institutes of Health (R01-NS084941) et la Commission de recherche biomédicale en Arizona (ADHS16-162406) à PTR. WA a reçu au-delà de prise en charge d’une nomination pré-doctoral à une bourse de formation du instituts de santé National (T32-HL007249).
Materials
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
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